了解氟化物对肝组织损伤机制

《了解氟化物对肝组织损伤机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、了解氟化物对肝组织损伤机制　　氟广泛存在于地球上,是机体必需的微量元素之一,适量的氟有利于维持机体钙磷代谢和保持神经兴奋的传导。但过多摄入可导致肝肾等多种组织器官的广泛损伤。前期实验表明,过量氟化物导致大鼠肝细胞DNA损伤,并可诱导细胞凋亡,本研究观察氟化物对肝组织caspase-3、caspase-9基因表达水平,明确氟化物导致大鼠肝细胞DNA损伤并诱导细胞凋亡是否与caspase-3、caspase-9基因表达水平有关,进一步了解氟化物对肝组织损伤机制。　　1、材料与方法　　1.1主要试剂和仪器　　RNAisoPlus总RNA提取试剂(TaKaRa公司)、5PrimeScr

2、iptRTMasterMix试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、反转录SYBRPremixExTaqTMII试剂盒9(大连宝生物工程有限公司)、DNAMarker(大连宝生物工程有限公司)、琼脂粉(西班牙)、高速冷冻离心机3-18K(美国Sigma公司)、PTC-200PCR仪(美国Bio-Rad公司)、ABI7300全自动荧光定量PCR(美国ABI公司)、可调微量移液器(德国eppendorf公司)。　　1.2动物分组、肝系数测定及标本的采集　　清洁级雄性SD大鼠48只,体重(100±10)g,由山西医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(晋)2009-

3、0001。将SD大鼠观察1周适应环境后,随机分为4组,每组12只,各组均饲喂大鼠正常饲料,对照组、低氟组、中氟组和高氟组分别自由饮用含0,50,100,200㎎/L氟化钠去离子水。动物饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境[SYXK(晋)2009-0001],每月测定实验动物体重,观察体重变化,染毒120d。染毒结束,称量最后一次体重,麻醉后经右心灌注生理盐水,冲洗肝内血液,快速对大鼠的肝组织进行取材,用滤纸吸干表面血液,称重,测定肝系数[肝系数=肝质量(g)/体质量(g)100%]。将肝组织迅速放入液氮中速冻,然后转移至-80℃冰箱保存,以备实时荧光定量PCR检测。　　1.3

4、肝组织中caspase-3、caspase-9基因表达的实时荧光定量PCR检测　　称取低温冻结的肝组织100mg加液氮研磨成粉末状,按RNAisoPlus试剂说明操作,提取总RNA,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳进行肝组织总RNA质量鉴定,核酸分析仪测量其浓度,用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。以β-actin作为内参照,caspase-3上游引物:5-AGCCATGTACGTAGC-CATCC-3,下游引物:5-GGCGCAAAGTGACTG-GATGA-3,产物长度147bp;caspase-9上游引物:5-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3,下游引物

5、:5-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3,产物长度176bp;β-actin上游引物:5-AGCCATGTACG-TAGCCATCC-3,下游引物:5-ACCCTCATAGAT-GGGCACAG-3,产物长度115bp。然后进行扩增:95℃30s;然后95℃5s,60℃30s,40个循环,添加溶解曲线,反应结束后,电脑自动输出溶解曲线及对应Q值(达到阈值循环数)和扩增曲线。取6μlPCR产物经2%琼脂糖进行凝胶电泳,采用凝胶成像系统观察,以进行PCR产物鉴定。　　1.4实验数据处理及分析　　相对表达量比较采用2-ΔΔCt

6、法分析,表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。ΔCt(染氟组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔCt(对照组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔΔCt=ΔCt(染氟组)-ΔCt(对照组)。目的基因的相对表达水平=2-ΔΔCt。　　样品的阈值线设置相同,采用SPSS13.0统计软件计算重复样品间Ct均值及标准偏差,应用2-ΔΔCt法处理数据。　　1.5统计学分析　　实验数据采用SPSS16.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析及L

7、SD-t法检验。　　2、结果　　2.1不同染氟时期大鼠的体重变化　　从表1可知,染氟过程中各组大鼠生长发育良好,体重均明显增加。经统计分析,不同时期各染氟组体重与相应的对照组相比,差异无统计学意义,各染氟组之间体重两两比较差异也无统计学意义。　　2.2氟对各组大鼠肝脏脏器系数的影响　　从表2可知,染氟组大鼠肝脏脏器系数与对照组相比,差异无统计学意义;各染氟组间比较差异也无统计学意义。　　2.3肝脏组织总RNA的浓度和纯度　　大鼠肝脏RNA经提取纯化后,在1.0%琼脂糖凝胶电泳进行快速分析(1