pcr技术在环境微生物检测中的应用

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1、环境科学15卷4期PCR技术在环境微生物检测中的应用胡稳奇张志光,41000(湖南师范大学生物系长沙6),,、摘要多聚酶链式反应技术(PcR)近年来已广泛应用于环境微生物检测中与常规方法比较它具有灵敏度高。,特异性强及快速简便等优点本文简要介绍了PCR技术的基本原理PCR应用于环境微生物检测的方法学及其应用现状与前景。关锐词多聚酶链式反应,环境微生物学,检测。、,多聚酶链式反应技术(polymerasechainDNA样品一对引物及4种脱氧核昔酸(dNTP),..,ReaetionR),KBMulxis和℃)DNA简称Pc是美

2、国学者首先加热(95使模板变性解链为单链..。〔‘〕,RKsaik等于1985年首创的作为一种特异DNA随即一对引物分别与模板DNA的2条单,、。性DNA体外扩增技术PcR具有特异性灵敏度链的两端互补杂交这时反应温度降至适宜的温、,,、高快速简便和重复性好等优点应用该方法可度在适宜离子强度pH和4种脱氧核昔酸等条,使极微量的特异DNA片段在几小时内(2一4h)件下由DNA聚合酶催化引物引导的DNA链的,。。迅速扩增百万倍以上从而有利于对DNA分子延伸至此完成了PCR第一轮反应继之又开始,。。检测增加其特异性与灵敏度川从PcR技

3、术发加热变性和退火进入第二轮反应由于在第一轮,明至今虽然仅有不到10年时间它的应用已涉反应中新扩增的DNA链又可作为第二轮反应的。,”。及几乎整个生命科学的领域模板DNA链拷贝数以2增加上述反应周而复,,,,近几年来随着PcR技术的不断发展与完始循环往复经20一30轮反应后目的DNA成,,善它在环境微生物学中也得到了广泛的应用百万倍扩增。,,有关这方面的文献报道日益增多至今已达10PcR技术创立之初在PCR反应中使用的。,.川PcR‘余篇技术创立之初期各国环境微生物DNA聚合酶是来源于大肠杆菌(E诫)的DNA,,,学工作者即开

4、始应用该技术检测环境中的特定聚合酶I的Klenow大片段由于该酶不耐高温。,微生物类群或基因型近年来随着PCR技术本因而必须在每轮反应中加入新酶给其操作带来,,。..身的发展其特异性和灵敏度不断提高各国环了困难1988年美国cetus公司的RKSaiki等境微生物学工作者研究的重点主要集中于以下从一种嗜热细菌中分离到可耐95℃高温的DNA:一,2个方面¹应用PcR技术研究某一特定环境中聚合酶TaqDNA聚合酶从而解决了上述困、,。,微生物区系的组成结构并进而了解其种群动难闭继之又发明了PcR扩增仪使PCR反应的;R,态º应用P

5、c技术监测环境中特定种群(如致实验操作完全自动化从而促进了PCR技术在、。。病菌工程菌株)的动态各个研究领域的更广泛应用,研究表明虽然PCR反应的基本原理已十1PCR技术的基本原理与方法川,分简单明了但其反应本身及整个循环中不断变RDNA、、、PC技术是特异性体外扩增的一种非化着的温度产物引物dNTP及DNA多聚酶的,常快速而简便的新方法其反应主要包括以下3浓度等存在着极为复杂的动力学关系川。影响:DNA(;、个过程¹双链模板)加热变性为单链ºPcR反应的主要因子是反应液中DNA多聚酶。引物与模板DNA单链结合;»引物延伸(扩

6、增)、dNTP、DNAs,+。,引物模板及M的浓度因此在:其基本原理与反应过程是在PcR反应缓冲液,、中分别加入一定量的DNA聚合酶待扩增194年2月6日收到修改稿15卷4期环境科学,、PcR每一新的应用中常需反复试验从而找到其是必须从水样土样或空气样本等环境样品中提,,最佳反应条件这一点对于PcR在环境微生物取到纯化的DNA或RNA然后以此为模板进行。。检测中的应用尤其重要因为从环境样品(如水PcR扩增近年来各国研究者对从环境样本中、,样土样或空气样本)提取的DNA或RNA的量提取核酸进行了深入的研究(steffan等,,。

7、往往是极其微量的即模板DNA的量极微量如1991)阁从环境样本中提取核酸的方法主要包,:一、、果反应条件控制不好常会出现扩增后见不到产括氯化艳溟化乙锭超速离心亲和层析酚/氯。、物或产物浓度太低而无法检测出来[5j环境样品仿抽提乙醇沉淀及聚乙烯聚毗咯烷酮(PvPP),。PCR检测的另一个困难就是待扩增样品往往含处理等有时是上述几种方法的结合,有较多的非特异性DNA或RNA从而拟制特异最近几年一些研究者提出了多种从水体样DNA3,,性的扩增或造成扩增产物出现非特异性背〔〕一般说来本中提取核酸的方法从水样中提,。。景区带影响产物的检

8、测困取核酸比从土样或空气样品提取更简单一些多,近年来很多研究者对环境样本的PCR的数情况下是首先对水样进行过滤收集微生物细巨5’6二,,适宜条件进了深入研究S‘effan等(1991)胞然后用溶菌酶处理微生物使核酸从细胞中释行巨3〕。us6,,对此作了综述Mlli等(1957