KJ 202105 水产品中地西泮残留的快速检测 胶体金免疫层析法

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食品快速检验方法犓犑２０２１０５水产品中地西泮残留的快速检测胶体金免疫层析法２０２１０５３１发布国家市场监督管理总局发布

1犓犑２０２１０５水产品中地西泮残留的快速检测胶体金免疫层析法１范围本方法规定了水产品中地西泮胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于鱼、虾中地西泮的快速定性测定。２原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中地西泮经有机试剂提取，固相萃取柱净化，浓缩复溶后，地西泮与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（Ｔ线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（Ｃ线）颜色深浅比较，对样品中地西泮进行定性判定。３试剂与材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的二级水。３．１试剂３．１．１甲醇（ＣＨ３ＯＨ）。３．１．２乙腈（ＣＨ３ＣＮ）。３．１．３二水合磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）。３．１．４十二水合磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。３．１．５氯化钠（ＮａＣｌ）。３．１．６合成硅酸镁吸附剂（ＭｇＯ３Ｓｉ），１２５μｍ～５００μｍ。３．１．７石墨化碳黑吸附剂（ＧＣＢ），３８μｍ～１２５μｍ。注：合成硅酸镁吸附剂和石墨化碳黑吸附剂，颗粒较细，谨防吸入。３．２参考物质地西泮参考物质的中文名称、英文名称、ＣＡＳ号、分子式、相对分子质量见表１，纯度≥９９％。注：或等同可溯源物质。表１地西泮参考物质的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称ＣＡＳ号分子式相对分子质量地西泮Ｄｉａｚｅｐａｍ４３９１４５Ｃ１６Ｈ１３ＣｌＮ２Ｏ２８４．７４３．３溶液配制复溶溶液：磷酸盐缓冲液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），称取８．０ｇ氯化钠（３．１．５）、２．７７ｇ十二水合磷酸氢二钠（３．１．４）、０．３５２ｇ二水合磷酸二氢钠（３．１．３），用水溶解并定容至１Ｌ。１

2犓犑２０２１０５３．４标准溶液配制３．４．１地西泮标准储备液（１００μｇ／ｍＬ）：精密称取地西泮参考物质（３．２）１０ｍｇ，精确至０．０１ｍｇ，置于小烧杯中，用甲醇（３．１．１）溶解，定量转移至１００ｍＬ容量瓶中，再用甲醇（３．１．１）定容，摇匀，配制成１００μｇ／ｍＬ地西泮标准储备液，４℃冷藏避光保存，有效期６个月。３．４．２地西泮标准中间液（１μｇ／ｍＬ）：精密量取地西泮标准储备液（３．４．１）５００μＬ加入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇（３．１．１）定容，摇匀，配制成１μｇ／ｍＬ地西泮标准中间液，４℃冷藏避光保存，有效期６个月。３．４．３地西泮标准工作液（１０ｎｇ／ｍＬ）：精密量取地西泮标准中间液（３．４．２）５００μＬ加入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇（３．１．１）定容，摇匀，配制成１０ｎｇ／ｍＬ地西泮标准工作液，临用现配。３．４．４标准溶液为外部获取时，管理及使用应符合相关规定。３．５材料３．５．１地西泮胶体金免疫层析试剂盒：一般包含金标微孔、胶体金检测卡，适用于水产品，按产品要求保存。３．５．２固相萃取柱：固相萃取柱套筒（１２ｍＬ体积）中塞入筛板，称取０．８ｇ合成硅酸镁吸附剂（３．１．６）加入柱内，使填料密实且表面水平，再塞入筛板压实，即完成固相萃取柱制备。若用于检测虾、黄鳝等含色素的样品，则填料为０．８ｇ合成硅酸镁吸附剂（３．１．６）、０．１ｇ～０．２ｇ石墨化碳黑吸附剂（３．１．７），混合均匀加入柱内，使填料密实且表面水平，再塞入筛板压实，制成固相萃取柱。或者使用同类商品化固相萃取柱。４仪器和设备４．１电子天平：感量为０．０１ｇ和０．０１ｍｇ。注：当实验室可获得符合规定的标准溶液时，无需配备感量为０．０１ｍｇ的天平。４．２离心机：转速≥４０００ｒ／ｍｉｎ。４．３移液器：量程为１０μＬ、２００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ。４．４涡漩仪。４．５氮吹仪。４．６孵育器：可控温２０℃～２５℃。４．７胶体金读数仪（可选）。５环境条件温度１５℃～３５℃，相对湿度≤８０％。６分析步骤６．１试样制备水产品取可食用部分，称取约２００ｇ具有代表性的样品，充分均质混匀，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。留样置于－２０℃保存。２

3犓犑２０２１０５６．２试样提取准确称取试样２ｇ（精确至０．０１ｇ）于１５ｍＬ离心管中。加入０．４ｍＬ水、６ｍＬ乙腈（３．１．２），涡漩混合３ｍｉｎ。加入约０．４ｇ氯化钠（３．１．５），涡漩混合３０ｓ。４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液备用。固相萃取柱（３．５．２）使用前加入３ｍＬ乙腈（３．１．２），使乙腈流过并弃去以活化固相萃取柱。将离心管中上清液转移至固相萃取柱（３．５．２），过柱并用空气压力将柱内残留液体全部吹出，收集所有样液。样液于４０℃～５０℃水浴氮气吹干，加入３００μＬ复溶液（３．３），涡漩混合３０ｓ，作为待测液。注：可用洗耳球或其他等效装置产生空气压力。６．３测定步骤测试前，将未开封的金标微孔和检测卡恢复至室温。吸取２００μＬ待测液置于金标微孔（３．５．１）中，反复抽吸４～５次，使微孔中试剂充分混匀，于孵育器中２０℃～２５℃孵育３ｍｉｎ。吸取１００μＬ混匀液垂直滴于检测卡（３．５．１）加样孔中，于孵育器中２０℃～２５℃反应５ｍｉｎ，根据示意图判定结果，在１ｍｉｎ内进行判读。６．４质控试验６．４．１每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。空白试样应经参比方法检测且未检出地西泮。６．４．２空白试验：称取同类基质空白试样，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。６．４．３加标质控试验：准确称取同类基质空白试样２ｇ（精确至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ离心管中，加入１００μＬ地西泮标准工作液（３．４．３），使试样中地西泮含量为０．５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。７结果判定要求采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图１和图２所示。注：也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则参照读数仪的使用说明书。７．１比色法７．１．１无效控制线（Ｃ线）不显色，表明不正确操作或检测卡无效。７．１．２阳性结果检测线（Ｔ线）不显色或检测线（Ｔ线）颜色比控制线（Ｃ线）颜色浅，表明样品中地西泮含量高于方法检测限，判为阳性。７．１．３阴性结果检测线（Ｔ线）颜色比控制线（Ｃ线）颜色深或者检测线（Ｔ线）颜色与控制线（Ｃ线）颜色相当，表明样品中地西泮含量低于方法检测限，判为阴性。３

4犓犑２０２１０５图１目视判定示意图（比色法）７．２消线法７．２．１无效控制线（Ｃ线）不显色，表明不正确操作或检测卡无效。７．２．２阳性结果控制线（Ｃ线）显色，检测线（Ｔ线）不显色，表明样品中地西泮含量高于方法检测限，判为阳性。７．２．３阴性结果检测线（Ｔ线）与控制线（Ｃ线）均显色，表明样品中地西泮含量低于方法检测限，判为阴性。图２目视判定示意图（消线法）７．３质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。８结论当检测结果为阳性时，采用参比方法进行确证。４

5犓犑２０２１０５９性能指标９．１性能指标计算方法按照附录Ａ执行。９．２检出限：０．５μｇ／ｋｇ。９．３灵敏度：≥９９％。９．４特异性：≥９５％。９．５假阴性率：≤１％。９．６假阳性率：≤５％。１０其他本方法所述试剂、试剂盒信息、操作步骤及结果判定要求是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，应对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比方法为ＳＮ／Ｔ３２３５—２０１２《出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法液相色谱质谱／质谱法》（包括所有的修改单）。５

6犓犑２０２１０５附录犃（规范性）快速检测方法性能指标计算表性能指标计算方法见表Ａ．１。表犃．１性能指标计算方法检测结果ｂ样品情况ａ总数阳性阴性阳性犖１１犖１２犖１．＝犖１１＋犖１２阴性犖２１犖２２犖２．＝犖２１＋犖２２总数犖．１＝犖１１＋犖２１犖．２＝犖１２＋犖２２犖＝犖１．＋犖２．或犖．１＋犖．２显著性差异（χ２）χ２＝（｜犖１２－犖２１｜－１）２／（犖１２＋犖２１），自由度（犱犳）＝１灵敏度（狆＋）／％狆＋＝犖１１／犖１．×１００特异性（狆－）／％狆－＝犖２２／犖２．×１００假阴性率（狆犳－）／％狆犳－＝犖１２／犖１．×１００＝１００－灵敏度假阳性率（狆犳＋）／％狆犳＋＝犖２１／犖２．×１００＝１００－特异性相对准确度ｃ／％（犖１１＋犖２２）／（犖１．＋犖２．）×１００注：犖为任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：犖１１表示第一行，第一列；犖１．表示所有的第一行，犖．２表示所有的第二列；犖１２表示第一行，第二列。ａ由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。ｂ由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。ｃ为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：江西省食品检验检测研究院。本方法验证单位：浙江省食品药品检验研究院、四川省食品药品检验检测院、天津海关动植物与食品检测中心、南昌海关技术中心、江西省产品质量监督检测院。本方法主要起草人：张威、郭平、张文中、沈泓、姚欢、兰伟、王栋、肖亚兵、占春瑞、万承波、万建春。６