水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法

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附件5水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法（征求意见稿）1范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。2原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1正己烷。3.1.2丙酮。3.1.3乙酸乙酯。3.1.4乙腈3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。3.1.7氯化钠3.1.8复溶液：称取0.12g磷酸二氢钠(3.1.5)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16g(3.1.6)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A2.8ml、溶液B7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至100ml，得磷酸盐缓冲液。3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。3.2标准物质氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%表1氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量氯霉素chloramphenicol56-75-7C11H12CL2N2O5323.13注：或等同可溯源物质。5

13.3标准溶液配制3.3.1氯霉素标准储备液（1mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（3.2）适量，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。3.3.2氯霉素标准中间液A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。3.3.3氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10μg/mL）（3.3.2）0.01mL分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01 μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。3.4材料3.4.1固相萃取小柱：CleanertSilica，200mg/6ml。LOT：01701983.4.2免疫胶体金试剂盒（在2℃～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。3.4.2.1金标微孔。3.4.2.2试纸条或检测卡。4仪器和设备4.1移液器：200μL、1mL和5mL。4.2涡旋混合器。4.3离心机：转速≥4000r/min。4.4电子天平：感量为0.01g。4.5振荡器。4.6样品浓缩仪：如有需要。4.7环境条件:温度：15℃～25℃，相对湿度：≤60%。5分析步骤5.1试样制备取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。5.2试样提取和净化准确称取试样6g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入4mL水和8mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5min，以4000r/min离心5min。转移全部乙酸乙酯层于50mL具塞离心管中，加入正己烷25ml，氯化钠1g涡旋混匀，4000r/min离心1min，上清液待净化。5ml丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5ml丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液。5.3测定步骤5.3.1检测卡与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8min，对结果进行判定。5.3.2试纸条与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育35

2min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5min内进行结果判定。5.3.3检测卡测定步骤吸取150µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8min，对结果进行判定。5.4质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1空白试验称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2加标质控试验准确称取空白样品6g或适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入60μL氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.1μg/kg，一式2份，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6结果判定要求通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。6.1无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。6.2阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。6.3阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。5

36.4质量控制要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7结论如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。8性能指标8.1检测限：氯霉素为0.1μg/kg。8.2灵敏度：灵敏度应≥98%。8.3特异性：特异性应≥90%。8.4假阴性率：假阴性率应≤1%。8.5假阳性率：假阳性率应≤10%。注：性能指标计算方法见附录A9其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定(包括所有修改单)。5

4附录A定性方法性能计算表表A.1性能指标计算方法样品情况a检验结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(χ2)χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1灵敏度（p+）p+=N11/N1.特异性（p-）p-=N22/N2.假阴性率(pf-)pf-=N12/N1.=1-灵敏度假阳性率(pf+)pf+=N21/N2.=1-特异性相对准确度（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。a由基准方法检验得到的结果；b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。5