食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法

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附件13食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法征求意见稿1.范围本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。第一法比色法2.原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）、控制线（C线）的颜色深浅对比进行结果判读。3.试剂及材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T6682规定的二级水。3.1.试剂3.1.1.乙腈。3.1.2.甲醇+水（7+3，体积比）。3.1.3.稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）。3.2.参考物质3.2.1.玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。表1玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36注：或等同可溯源物质。3.3.标准溶液的配制3.3.1.标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，制成浓度为100μg/mL的标准储备液。﹣18℃避光保存，有效期6个月。

11.1.1.标准工作液：准确量取标准储备液（100μg/mL）（3.3.1）100μL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2～8℃避光保存，有效期1个月。1.2.材料玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。2.仪器和设备2.1.移液器：100μL、200μL、1mL和5mL。2.2.旋涡混合器。2.3.离心机。2.4.电子天平：感量为0.01g。3.环境条件环境温度：20～30℃。空气相对湿度：最佳测定湿度45%～65%。若湿度低于45%，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65%～80%，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮，避免高湿环境下（湿度80%以上）进行实验。4.分析步骤4.1.试样制备取适量样品，充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。4.2.提取准确称取试样5.0g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3min，离心分层或静置分层，上清液备用。准确移取0.8mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5mL离心管中，加入25μL上清液，混匀，待检。4.3.测定步骤依检验所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200μL于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10min。将试纸条插入金标微孔中，反应3min～5min。从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色结果，进行判定。（若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验操作环境温度。）5.质控试验每批样品应该同时进行空白试验和阳性质控试验。5.1.空白试验准确称取空白试样，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。5.2.阳性质控试验

2准确称取玉米赤霉烯酮含量为60μg/kg的质控样，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60μg/kg，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。1.结果判定通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。1.1.无效结果无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，C线都会出现一条紫红色条带。若控制C线未显色，表明操作过程不正确或试纸条已失效，检测结果无效。无效图1试纸条目视判定图1.2.阳性结果控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性。1.3.阴性结果控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性。比色法图2试纸条目视判定图1.4.质控试验要求空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。

3第二法消线法1.原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行判读结果。2.试剂及材料同3。3.仪器和设备同4。4.环境条件环境温度：10～40℃。空气相对湿度：同5。5.分析步骤5.1.试样制备同6.1。5.2.提取准确称取试样5.0g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入12.5mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3min，离心分层或静置分层，上清液备用。准确移取400μL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5mL离心管中，加入上清液(小麦50μL，玉米80μL），混匀，待测。5.3.测定步骤同6.3。6.质控试验同7。7.结果判定通过检测T线显色与否进行结果判定。7.1.无效同8.17.2.阳性结果控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性。7.3.阴性结果控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性。

4消线法图3试纸条目视判定图1.质控试验要求同8.42.结论本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB2761指定方法标准检测并判定。3.性能指标3.1.检出限：60μg/kg。3.2.灵敏度：灵敏度≥95%。3.3.特异性：特异性≥90%。3.4.假阴性：假阴性≤5%。3.5.假阳性：假阳性≤10%。注：性能指标计算方法见附录A。4.其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。本方法参比标准为GB5009.209-2016食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定。

5附录A快速检测方法性能指标计算表样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异（c2）c2=（½N12-N21½-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a样品中实际的公议值结果；b由玉米赤霉烯酮胶体金试纸条检验方法得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法起草单位：成都市食品药品检验研究院。本方法参与单位：江南大学、国家粮食局科学研究院、广东省食品检验所、山东省食品药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院。本方法主要起草人：肖全伟、姚蕾珺、王昕、张敏、胥传来、田洪芸、沈泓、周露