elisa技术原理及应用医学ppt

《elisa技术原理及应用医学ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Elisa原理及应用简介(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)Elisa发展Elisa原理常用检测方法应用前景ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。其是继免疫荧光（IFA）和放射性免疫（RIA）分析技术之后，建立起来的用酶来标记抗原或抗体的分析技术。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种检测未知抗体或

2、抗原的敏感性很高的试验技术。反应的基础：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记（结合在固相载体的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，而酶标记的抗原或抗体既保持其免疫学活性又保留酶的活性）；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。抗原定义：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等；小分子化合物在与大分子蛋

3、白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原；例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。ELISA的原理抗体定义：抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)，Ig分五类即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。Ig由两个轻链L和两个重链H的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ和λ两种型别，五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。特点:可逆性：抗原抗体的结合是动态平衡过程；特异性：抗原

4、抗体化学结构互补，高度特异；最适比例；抗原抗体的含量应保持最适合的比例；敏感性：标记的免疫敏感度可达ng/mlELISA的原理ELISA方法中三个必要的试剂固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA的检测类型固相载体具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚苯乙烯ELISA反应中最常用的固相载体，具有较强的吸附蛋白质的性能。在

5、ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。ELISA的检测类型概念：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯

6、固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。包被的方式ELISA的检测类型ELISA常用酶ELISA的检测类型包被目的抗体加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去未结合的其他物质加酶标抗体生成抗体-待测抗原-酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行抗原的定

7、性或定量测定实验基本流程图ELISA的检测类型双抗夹心法：双抗体夹心法测抗原和双抗原夹心法测抗体间接法测抗体（常用）竞争法：竞争法测抗原与竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素—生物素ELISA法ELISA的检测类型双抗体夹心法测抗原特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标记抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关。加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量ELIS

8、A的检测类型双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。ELISA的检测类型间接法测抗体酶标二抗底物间接法是检测抗体常用的方法，其原理为利用酶标记的二抗（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。其检测方法：固相(包被)抗原Ag+样品(抗体Ab)+酶标二抗A