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1、ICs11。020CO5中华人民共和国国家标准GB/T26349-2o1o蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法Test1nethodsoF1田yresistancetoinsecticidesˉˉTestInethodsofinsensitiveacetyIcholinesterasef①rmuscadomestica⒛i1-0卜10发布2011-05-01实施中华人民共和国卫生部发布中国国家标准化管理委员会GB/T2s349-ˉ201o前言本标准按照GB/T1.1一zOOg给出的起草规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口
2、。本标准起草单位:中国农业大学、北京市疾病预防控钔中心、中国人民解放军军事医学科学院馓生物流行病研究所。本标准主要起草人:高希武、曾晓亢、梁沛、马彦、刘婷、佟颖、赵肜言。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T26349-2o1o蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法1范围本标准规定了家蝇0饧sc四J缸c色)不敏感乙酰胆)的检测方法本标准适用于家蝇对有、氨基甲夔巾关荮衬抗药挂的生呖检测。2术语和定义下列术语和定2.1乙酰胆碱酯能够抑制单位为mol/L或mmol/L。2.2F1代Fl从现场捕www.bzfxw.com3试虫现
3、场采集储存不超过1d,-20℃条件下4试剂4.1磷酸氢二钠(N州4.2磷酸二氢钾(KH24.3曲拉通℃100(TⅡ4.4乙酰硫代胆碱(ATCω,4.55,5’-二硫双硝基苯甲酸(4.6磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.512H20和2.16gKH2Po4,蒸馏水定容至1000mL。4.7DTN⒊乙醇显色剂:称取12。4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中,加人50mL磷酸缓冲液,最后用蒸馏水定容至250mL,4℃避光保存。4.8ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,一zO℃避光保存。5分光光度法5.1仪器设备
4、5.1.1分光光度计。GB/T26349-20105.1.2恒温水浴箱。5.1.3玻璃组织匀浆器。5.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。5.1.5加液器。5.2杀虫药剂的配制(含0.1%Tritonr用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液100)稀释到区分浓度酶的区分浓度见表A。1)的2倍,溶剂(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯在反应体系中的最终浓度应小于1%。5.3操作步骤(切)下,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器(1mL)5.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪中,加人0.5mL4℃预
5、冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonⅪ100),充分匀浆。5.3.2匀浆液在4℃,10000g离心15min,取上清液即为酶液,冰浴保存备用。5.3.3取4支试管,分别加人上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人一定量的杀虫药剂溶液0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取o。1mL,使其终浓度达到区分剂量,第4支试管中加人1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。5.3.4上述5支试管30℃保温5min后,分别加入0.1mLATCh,在30℃继续保温15min后,加人1.6mLDTN⒏乙醇显色剂。5.3.5以空白对照调
6、仪器0点,在分光光度计中于狃2nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(OD412)。www.bzfxw.com5.3.6按上述方法每个种群检测100只家蝇。5.4结果表述(1):测定AChE残存活性的计算见公式E=旦坠×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)oD式中:E——AChE残存活性;0Dt——药剂处理管平均光密度值oD"2;乙瓦——无药剂对照管平均光密度值OD412。5.5判别标准AChE残存活性大于⒛%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到zO%时
7、为抗性种群。6酶标仪法6.1仪器设备6.1.1酶标仪。6.1.2恒温水浴箱。6.1.3玻璃组织匀浆器。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T26349-201o6.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。6.1.5加液器。6.2杀虫药剂的配制用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A。2)的2.5倍,溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。6.3操作步骤6.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀
8、或手术刀片将头部剪下,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器(1mL)中,加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%Tritonr1oo),充分匀浆。6.3.2匀浆液在4℃,10ooog离心15m
