wst 594-2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法

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1、ICS11.020C05WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T594—2018蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法Testmethodsofflyresistancetoinsecticides-AmolecularmethodfordetectinginsensitiveacealleleintheMuscadomestica2018-03-01发布2018-08-01实施中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布WS/T594—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、

2、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩。IWS/T594—2018蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法1范围本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase

3、存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。2.2等位基因allele存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。2.3342G、342V和342A342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）。3样本采集采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在4℃条件下短期（6个月内）保存，可在-20℃以下长期保存。4引物引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列为CGTAACCGC

4、TAAGATCTGCTG。引物设计参照附录A。配制为10μmol/L浓度，保存于-20℃冰柜。5仪器设备5.1PCR（聚合酶链式反应）仪。5.2琼脂糖凝胶电泳仪。1WS/T594—20185.3凝胶成像仪。5.4恒温水浴锅。6主要试剂6.1DNA聚合酶（Taq酶）。6.2限制性内切酶Bsp1286I。6.3限制性内切酶EaeI。7操作步骤7.1在PCR管中加入10×PCR缓冲液(含100mmol/LTris-HCl,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，引物F0.5μL，引物R0.5

5、μL，单头家蝇的基因组DNA1μL（100ng～300ng，提取方法可参见附录B，也可用商售的DNA提取试剂盒或其他类似方法提取）和Taq酶(2～5个单位)，用灭菌水补齐至25μL，混匀。7.2将PCR管放入PCR仪中，设置PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。运行程序。7.3PCR运行结束后，取5μLPCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳20min后在紫外光下检测，有清楚单一的609bp的条带的PCR产物用于进行以下酶切反应。7.4取合格样品（即电泳检测

6、产物为609bp）的PCR产物设置两个酶切反应，反应A用Bsp1286I酶、反应B用EaeI酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录C）。7.5将酶切后的产物上样在1.5%的琼脂糖凝胶上，电压设定在160V，电泳20min后在紫外光下检测。8基因型确定根据酶切产物的电泳结果（参见附录D），确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型，见表1。表1家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定反应I(加Bsp1286I酶切)反应II(加EaeI酶切)乙酰胆碱酯酶342氨基酸位点基因型361bp、248bp609bp敏感型纯合子（G/G）609bp609b

7、p不敏感I型纯合子（V/V）609bp361bp、248bp不敏感II型纯合子（A/A）609bp、361bp、248bp609bp不敏感I型/敏感型杂合子（G/V）609bp、361bp、248bp609bp、361bp、248bp不敏感II型/敏感型杂合子（G/A）609bp609bp、361bp、248bp不敏感I型/不敏感II型杂合子（V/A）注：G表示氨基酸残基为Gly（甘氨酸）；V表示氨基酸残基为Val（缬氨酸）；A表示氨基酸残基为Aal（丙氨酸）。2WS/T594—2018AA附录A（资料性附录）引物设计参照序列342VCGGTGCATT

8、TGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAG