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1、ICs11。020CO5中华人民共和国国家标准GB/T26348-2010蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酰胆碱酯酶法TestrnethodsofInosquitoresistancetoinsecticidesˉˉTestrnethodsoFinsensitiveacetyIchoIinesteraseforthemosquito⒛11-O⒈14发布2011-05-01实施中华人民共和国卫生部发布中国国家标准化管理委员会GB/T26348-2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本
2、标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院馓生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人:赵彤盲、汪中明、李春晓、茧盲德、高希武、曾晓亢、佟颖。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T26348-2010蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酰胆碱酯酶法1范围本标准规定了蚊虫体内不胆碱酯酶(ACh测方法。本标准适用于淡色库蚊(sg〃饣″g昭nsc饣ε彦仍s)、叻饣召饣白纹伊蚊(A纟d召s@J3op讠c拟s)、中ssj″召勿sjs)挚竽甲酸酯类杀虫剂抗性的生物化学检测。2术语和定义下列术语和2.1乙酰胆碱能够抑制
3、3试虫www.bzfxw.com现场多点,室内饲仵下储存不超过1d,-20℃条不超过4试剂4.1磷酸氢二钠(4.2磷酸二氢钾(Κ4.3曲拉通Ⅺ100(T4.4乙酰硫代胆碱(A4.55,5’-二硫双硝基苯甲4.6磷酸缓冲液(0.1mol/L,pPBs):称取30.18gNazd·12H20和2.16gKH2Po4,蒸馏水定容至1000mL。4.7DTN⒊乙醇显色剂:12.4mgDTNB,加120mL95%乙醇,80mL蒸馏水,50mL磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Triton莎100)。4.8ATCh溶液:称取28.
4、9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,—20℃避光保存。4.9ATCiDTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。5分光光度法5.1仪器设备5.1.1分光光度计。1GB/T26348-20105.1.2恒温水浴箱。5.1.31mL玻璃组织匀浆器。5.1.4离心机(离心力10000g以上)。5.1.5加液器。5.2操作步骤5.2.1酶源的制备取成蚊5只做为1组,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入0.5mL磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Tritonr100),充分匀浆。匀浆液
5、在4℃,5000g离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。5.2.2取6支试管,分别加人6.1.1中制各酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人0.1mL的杀虫(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附剂溶液,充分混匀,使其终浓度达到区分浓度1%。另3支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;录A表A。D,且丙酮终浓度小于再取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。5.2.3上达7支试管30℃保温5min后,分别加人0.1mLO。01mol/L乙酰硫代胆碱(ATCh),在30℃继续保温15mh后,加人
6、3.6mLDTN⒊乙醇显色剂。5.2.4将空白对照调至仪器显示为0点,在分光光度计中于狃2nm波长下测定无药剂对照管和药剂(oD412),计算平均值。处理管的光密度值5.2.5按上述方法每个种群检测100组蚊虫。5.3结果表述www.bzfxw.com(1):测定AChE残存活性的计算见公式E=旦坠×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)oDc式中:E——AChE残存活性;oDt——药剂处理管平均光密度值oD412;—oDc—无药剂对照管平均光密度值OD砼12。5.4判别标准AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的
7、蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂抗性组,抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。6酶标仪法6.1仪器设备6.1.1酶标仪。6.1.2恒温水浴箱。6.1.31mL玻璃组织匀浆器。6.1.4离心机(离心力10000g以上)。6.1.5加液器。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T26348-20106.2操作步骤6.2.1酶源的制备取成蚊1只,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液充分匀浆。匀浆液在4℃,50oog离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。6.2.2分取0.1mL
8、6.2。l中钏备酶液到酶标板的3个孔中,再在各孔中加人0.1mL杀虫剂溶液,杀虫剂用磷酸缓冲液稀释,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见表A。D,且丙酮的终浓
