毕业设计（论文）-精氨酸激酶（ak）的提取与纯化

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1、学号编号研究类型基础研究分类号Q51毕业论文（设计）Bachelor’sThesis论文题目精氨酸激酶（AK）的提取与纯化作者姓名指导教师所在院系生物系专业名称生物科学完成时间2007年6月6日21主要符号对照表AK精氨酸激酶E.coli大肠杆菌IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷Kanamycin卡拉霉素CMCCM-CelluloseS-100SephacrylTM-1002-mercaptoethanol巯基乙醇Glycine甘氨酸PMSF苯甲基磺酰氟EDTA乙二胺四乙酸NaN3迭氮钠Arg精氨酸ADP二磷酸腺苷ATP三磷酸腺苷h小时min分钟21目录1引言11.1精氨

2、酸激酶（AK）11.2蛋白质的分离与纯化22实验试剂以及实验仪器：52.1实验材料52.2主要实验试剂与仪器83实验方法93.1活化菌种93.2扩大培养93.3IPTG诱导AK基因的表达93.4蛋白质提取93.5蛋白质的检测103.6蛋白质的纯化104结果与分析124.1AK诱导表达电泳图124.2蛋白质经CMC离子交换的层析谱图和电泳图134.3蛋白质经分子筛S-100交换的层析谱图和电泳图144.4蛋白质经Q－sepharose阳离子交换的层析谱图和电泳图164.5AK经各步纯化后的SDS-PAGE电泳图谱175讨论18参考文献：2021精氨酸激酶（AK）的提取与纯化摘

3、要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK基因的E.coliRosetta，在含有50μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。关键词：精氨酸激酶提取与纯化21Extractionand

4、PurificationofArginineKinaseAbstract：Arginine　kinase（ATP：L-argininephosphotransferase　EC2.7.3.3），playsanimportantroleincellularenergymetabolismininvertebrate.E.coliRosettawhichcontainsrecombinantAKgenewasgrowninLBmediumcontainingkanamycin(Finalconcentration:25μg/mL).Whenabsorbanceat600nmva

5、luewasbetween0.6with0.8,isopropylβ-D-thiogalactopyranosidewasaddedto0.2mMandtheincubationwascontinuedanaddition3h.Thecellwasbrokenandcentrifugated,thenthecrudecellextractwasharvested.Furthermoreitwaspurifiedbyfollowingthreemethodsinturn:CM-Cellulosepositiveionexchangechromatography,Sephacr

6、ylTM-100gelfiltratechromatography,andQ-Sepharoseanionexchangechromatography.ApurifiedAKwasfoundtobehomogenousbySDSpoly-acrylamindegelelectrophoresis.Keywords:argininekinaseextractionandpurification21精氨酸激酶（AK）的提取与纯化1引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶[1]（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+ArgM

7、g2+ADP+ArgininephosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeusaztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对