酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,.ppt

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1、酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)－乙肝两对半测定张君龙严琳临床免疫实验室2016年4月5日主要内容ELISA技术的实验原理ELISA技术的基本类型ELISA技术的操作流程乙肝病毒血清标志物乙肝两对半检测的临床意义酶免疫技术抗原抗体反应特异性酶高效催化反应的专一性酶免疫测定均相酶免疫组化酶免疫技术异相固相液相（定位，定性）（定性，定量）（ELISA）ELISA实验原理将抗体(或抗原)结合到固相载体表面，当加入标本后，相应待测抗原(或抗体)结合到固相

2、抗体(或抗原)上，利用酶标记抗体（或抗原)和相应底物，通过洗涤、显色，测定有色产物的含量，即可检测出标本中待测抗原(或抗体)。ELISA技术基本类型间接法（检测抗体）夹心法（检测大分子抗原；抗体）竞争法（检测小分子半抗原；HBcAb,HBeAb）捕获法（检测某抗体亚型成分，IgM测定）产物颜色深浅和含量成正比产物颜色深浅和含量成反比乙肝病毒血清标志物检测原理血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法H

3、BeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)HBcAb-IgM捕获法抗人IgMμ链HBcAg及HBcAb显色(+)ELISA操作流程图准备工作（试剂平衡，洗液配制，编号）加样加酶洗涤显色终止反应观察结果两步法需要温育洗涤温育操作步骤平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18-25℃)。配洗液：充分摇匀浓缩洗涤液，用蒸馏水按1:19稀释。（已配制）编号：将微孔条固定于支架，按序编号。操作步骤加样：分别用加样枪在孔

4、中加入待测血清样本50ul，阴、阳性对照50ul（1滴），空白不加。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul（1滴），空白不加，轻拍混匀。温育：贴好密封膜，置37℃温育30分钟。操作步骤洗涤：用洗涤液充分洗涤6次，洗涤完后扣干(每次洗涤保持30-60秒的浸泡时间)。显色：每孔加底物和显色剂各50ul（1滴），轻拍混匀，置37℃反应10分钟。终止：每孔加终止液50ul（1滴），混匀。观察结果：酶标仪或者肉眼判读。HBsAb检测——双抗原夹心法HBeAb检测——竞争法样本血清50μl；阴性、阳性对照各50μl（

5、1滴）；空白不加酶结合物50μl（1滴）；空白不加37℃温育30min洗板6次，扣干底物液50μl（1滴）+显色剂50μl（1滴）37℃反应10min每孔加入终止液50μl（1滴）酶标仪读数或者肉眼判断+抗原——待测抗原抗体——固相抗体+酶标记抗体介质——液体环境+固相载体（异相）现象——显色产物作用——定性，定量ELISA——双抗体夹心法antigenantibodysubstrateEnzyme-labeledantibodyELISA三个必要试剂固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶反应底物酶高效催化反

6、应的专一性抗原抗体反应特异性试剂盒组成包被板HBsAb－蓝色（包被HBsAg）HBeAb－紫红色(包被HBeAb和HBeAg)酶标记物（HRP标记）试剂盒组成底物液（过氧化物）和显色剂（TMB）终止液（H2SO4）洗涤浓缩液（PBS）阴性对照和阳性对照结果判断肉眼判定：通过显色与否判定阴阳性酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并根据cut-off值判定结果夹心法：OD值>cut-off值为阳性竞争法：OD值

7、D值+阳性OD值)/2注意事项严重溶血、脂血、浑浊、细菌污染可影响结果。所有样本都应按传染源处理。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同厂家、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。试剂使用前需复温，浓缩洗涤液配制前应充分摇匀。注意事项加样本时要加到孔底，避免产生气泡。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀，滴加试剂时应弃去第一滴。温育时，标本要贴好密封膜，防止水蒸气和污物浸入。洗涤要彻底，各孔须加满洗液，防止孔口有游离酶残留；每次洗后应拍干；不可加水过猛，避免产生气泡及孔与孔之间的交

8、叉污染。ELISA影响因素钩状效应——主要影响ELISA一步法的检测，由于被检测血清中（抗原或抗体）浓度过高，可出现类似于后带现象的假阴性结果。高浓度的RF——会影响双抗体夹心法和捕获法的检测，出现假阳性结果。钩状效应(Hookeffect)抗原或抗体量抗原抗体复合物量一步法二步法假阴性加入待测抗原—温育—洗涤—加入酶标抗体—温育同时加入待测抗原和酶标抗体—温育抗原或抗体量抗原抗体复合物量高浓度RF致双抗体夹心法