高效液相色谱讲解电子教案.ppt

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1、高效液相色谱讲解1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量

2、的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！3.应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发

3、性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量17.2HPLC仪器HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所

4、示。He储液瓶分布器过滤2m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器HPLC仪器详解1.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的

5、匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种

6、或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。2.进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱

7、柱3.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其

8、延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。4.检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所