酶底物法快检技术检测生活饮用水中大肠菌群

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1、酶底物法快检技术检测生活饮用水中大肠菌群成都市疾病预防控制中心610041  关键词：酶底物法；大肠菌群；生活饮用水；快速检测 主要内容：1、实验原理2、仪器设备与试剂耗材3、实验步骤4、讨论与分析 实验原理该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂─指示剂」：邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖（ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为Colilert试剂的主要碳源。1、利用大肠菌群细菌能产生β2半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色，检测大肠菌群2、利用

2、大肠埃希氏菌产生β2葡萄糖醛酸酶分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌3、改变培养温度，可检测耐热大肠菌群因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在Colilert试剂里生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到Colilert特殊配方的基质选择性的抑制作用（专利技术）。 酶底物法技术特点1、减少杂菌干扰2、无培养基干扰（传统方法常会因清洁剂、盐、抗生素、毒素、温度造成抑制反应）3、结果准确，减少假阳性反应与假阴性反应4、测试结果快速，18或24

3、小时报告5、判读容易6、操作简便，使操作人员从繁杂的检测工作中解放出来 仪器设备和试剂耗材1、程控定量封口机Quanti-TraySealerModel2X美国IDEXX；2、可充电紫外灯，6W，220V，366nm；3、紫外线防护镜；4、DST酶底物法24小时Colilert试剂美国IDEXX；5、51孔定量盘（无菌）；97孔定量盘（无菌）6、阳性标准比色瓶，阳性51孔标准比色盘；7、100mL含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶。 实验方法1、定性实验大肠菌群、大肠埃希氏菌：取100mL水样加入酶底物试剂1支混

4、匀，于36±1℃培养24h，观察结果。耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为44.5±0.5℃结果判定：可见光下水样变为黄色，报告检出大肠菌群/耐热大肠菌群；紫外灯下水样有蓝色荧光，报告检出大肠埃希氏菌。否则报告未检出。 2、定量实验?51孔定量盘法，97孔定量盘法大肠菌群、大肠埃希氏菌：取100mL水样加入酶底物试剂1支混匀，转入51孔定量盘内（或97孔定量盘），封口后于36±1℃培养24h，观察结果。耐热大肠菌群：实验同上，但培养温度变为44.5±0.5℃结果判定：可见光下计数51孔定量盘内黄色孔数，

5、紫外灯下计数有蓝色荧光孔数，再查表《51孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》或《97孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》得出数值，结果以MPN/100mL报告。 讨论与分析1、酶底物法与多管发酵法的比较多管发酵法和酶底物法均用于生活饮用水中大肠菌群的定量测定，但两法比较有如下特点：①方法接种量不同。多管发酵法水样接种55.5mL，酶底物法水样接种100mL。②方法量程不同。多管发酵法检测范围是2-1600（MPN/100mL），酶底物法检测范围是1.0-200.5（

6、MPN/100mL）。③方法灵敏度不同。多管发酵法为每100mL样本中2cfu；酶底物法为每100mL样本中1cfu。④方法步骤不同。多管发酵法为多步骤测定，费时费力；酶底物法为一步测定，省时省力。⑤方法耗时不同。多管发酵法对于阴性水样需24小时报告结果，对于阳性水样则需72小时报告结果；酶底物法无论阴性或阳性水样均可24小时报告结果。⑥方法费用不同。多管发酵法可使用半成品培养基或自配培养基，检测成本低廉，目前国内也开发有初发酵试验的成品培养基和一次性耗材，但由于阳性水样必须进行验证试验，从而限制了该商品

7、试剂的应用推广；酶底物法使用商品试剂，且目前只有国外生产商供应，使得检测成本较高，该法在东部经济发达地区使用较广。 2、酶底物法应用的优势与不足目前我国对生活饮用水进行卫生学评价,检测的微生物指标主要有大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌，这类指标是粪便污染的指示菌。经典的传统方法为多管发酵法，其检测周期较长，需2～5天，阳性结果需验证试验,使得实验操作步骤较为繁琐,不能对生活饮用水的卫生学状况做出快速评价，特别是在抗震救灾特殊时期，如能实现微生物指标的实时监测，将极大地支持抗震救灾工作地顺利实施，有力保

8、障广大灾区人民群众生活饮用水的供水安全。因此,酶底物法作为一种快检方法，其快速简便的特点可以较好的弥补传统方法的不足。酶底物法（enzymesubstratetechnique）的原理是：利用大肠菌群细菌能产生β2半乳糖苷酶（β2D2galactosidase）分解ONPG（Ortho2nitrophenyl2β2D2galactopyranoside）使培养液呈黄色，检测水样中是否含有大肠菌群。利用大肠埃希氏菌产生β2葡萄糖