水检测底物酶法测生活饮用水大肠菌群

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1、摘要：由于传统方法在检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌需要48小时左右,且操作过程复杂,难以掌握。现介绍一种快速简便的检测方法，根据生活饮用水国家卫生标准（GB/T5750-2006）中推荐的固定底物技术酶底物法可购买到市售化产品IDEXX公司的Colilert®试剂[1]。用于检测100ml水样，只需手工操作2分钟，即可在24小时内同时定量检测出大肠菌群和大肠埃希氏菌。此方法大大的减少了工作量，避免了使用多管法的逐级稀释带来的操作误差；也避免了使用滤膜法时肉眼读数的人为误差，所以其假阳性率和假阴性率都比传统方法低。由于24小时内就得到结果，可以很好

2、的用于突发事件应急。 关键词：大肠菌群 大肠埃希氏菌  固定底物技术酶底物法 Colilert试剂1.背景：目前我国对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生学评价，检测的指标为大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群（耐热大肠菌群），以这些指标作为粪便污染的指示菌。采用的标准检测方法为膜过滤法和多管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长，需48—72小时，需验证试验，试验步骤较为繁琐，所以不能对水的卫生学状况做出快速评价。因此，采用快速简便的检测方法十分必要。固定地物技术酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。2.原理[1]：固定底物技术酶底物法（Defin

3、edSubstrateTechnology）采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。固定底物技术酶底物法可以选用国标中推荐粉状培养基（IDEXX公司的Coil

4、iert试剂）来进行简便的操作；无需确认试验；固定底物技术酶底物法检测时间短，只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。3.试剂和设备：3.1 试剂：采用固定底物技术酶底物法市售化的MMO-MUG（MinimumMediaONPG-MUG）培养基—Colilert试剂[1]。3.2 耗材：取样瓶或使用灭菌的玻璃；51孔定量盘或97孔定量盘；注：51孔定量盘可在无需稀释的情况下检测1—200个目标菌/100ml水样；97孔定量盘可在无需稀释的情况下检测1—2419个目标菌/100ml水样。3.3 设备：定量程控封口机；366

5、nm紫外灯；阳性对照物注：定量程控封口机除了将定量盘进行封口外还对100ml水样平均分配到51个孔或者是97个孔中。4.操作方法：4.1 定性检测：4.1.1 适用范围：一般用于检测饮用水、瓶装水等；这些水样的结果是不得检出。所以只需用定性检测就可满足试验要求。4.1.2 操作步骤：1) 将一个Colilert试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。2) 放在36±1℃培养箱，培养24小时；注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5℃，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果

6、无效，需重做此水样。3) 根据下面的结果解释读取结果4) 无需确认试验4.2 定量检测4.2.1 适用范围：适用于任何一种水体。4.2.2 操作步骤：1) 将一个Colilert试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。（如图1）2) 将瓶内的水样全部倒入51孔或者是97孔定量盘中，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后使用定量程控封口机进行封口。3) 将定量盘放在36±1℃培养箱，培养24小时注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5℃，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则

7、结果无效，需重做此水样。4) 根据下面的结果解释读取结果。数出阳性格子数后对照MPN表得到结果。5) 无需确认试验5.测量范围5.1最低检出限Colilert试剂可以在24小时同时检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群），它可以在100ml水样中抑制2百万个杂菌干扰，最低检出限为每100ml水样可检测出1cfu的总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。5.2选用51孔定量盘在不稀释的情况下，100ml水样可检测200个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。5.3 选用97孔定量盘在不稀释的情况下，1

8、00ml水样可检测2419个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。6检测水样的范围l 饮用水l 源水l 瓶装水l 中水l