细胞总蛋白提取方法.doc

《细胞总蛋白提取方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、细胞总蛋白提取方法一、溶液配制1.100mMNaF(NaFMW=41.99)10ml称取NaF41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。2.100mMPMSF3.RIPA溶液100ml成分分子量终浓度Tris121.140.6g5.0mM(pH7.4)NaCl58.440.87g150mMEDTA372.2437.22mg1mMNP-401ml1%SDS0.1g0.1%脱氧胆酸钠0.5g0.5%溶解于80ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100ml。※使用前加入成分储存浓度加入量终浓度PM

2、SF100mM10μl/1ml1mMNaF100mM10μl/1ml1mMAprotinin10μg/μl0.2μl/1ml2μg/μlLeupetin10μg/μl0.2μl/1ml2μg/μl二、方法1.细胞收取1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞2)弃培养基，加入PBS2ml清洗培养皿一次，弃PBS。3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5mlependorf管中，10,000rpm×3min，4℃5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉

3、淀，10,000rpm×3min，4℃1)重复PBS清洗一次2)弃上清，-80℃冻存待裂解2.蛋白提取加入缓冲液前先将细胞沉淀敲散，加入后吹打细胞沉淀使其松散1)向细胞沉淀中加入200μlRIPA缓冲液(含1mMPMS、1mMNaF、2μg/mlAprotinin、2μg/mlLeupetin)，混匀后冰上放置40mins10,000rpm×15min，4℃将上清转移至一个新的ependorf管中（约250μl）三、注意事项1、低温可避免蛋白降解，所有离心管需预冷。2、PBS要吸干，但避免细胞干掉，以免使蛋白浓度过低。

4、3、整个蛋白提取过程要快，这能保证干预的效果。