荧光显微镜分析课件.ppt

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1、荧　光　显　微　镜基本知识荧光的性质保持固有的荧光特性荧光波长＞激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光染色分类：自发荧光二次荧光抗体荧光技术自发荧光（不加染色）有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。二次荧光（用化学染色）非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。荧光的种类自发荧光二次荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光

2、二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光染色不染色激发光发射光抗体荧光技术（用免疫染色）利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜的种类透射式落射式荧光的特性（1）荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某轴分布，形成镜象关系荧光发出时不像普通光那样会产生热效应，它是冷光。荧光的吸收及发射光谱30----180nm荧光发光方向与激发光的方向无关,它呈球体辐射。荧光具有偏振性。一、荧光显微镜原理原理：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为

3、激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。荧光显微镜的基本构造：由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。特点荧光：一般采用超高压汞灯(50-200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光

4、波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。光源滤光片激发滤光片：紧靠光源UV:340-380nm有色玻璃V:390-460nm种类：B:460-500nm干涉滤色片G:500-570nm截止滤光片：物镜与目镜间阻断(或压制)滤光片：吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛。选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。荧光显微镜就其光路来分有两种：1． 透射式荧光显微镜激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发

5、光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。透射荧光显微镜汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜透射荧光显微镜原理目镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯透射荧光显微镜的构造吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯箱优点：由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。缺点：必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。视场照明区不能

6、过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。厚的或不透明的标本不适用。2．落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。组成光源：高压汞灯或卤素灯。聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。

7、标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜荧光显微镜下的丝状细菌反射荧光显微镜原理汞灯激发滤色镜分色镜吸收滤色镜物镜标本优点：由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可以获得高分辨率的像。厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。可以避免不必要的荧光色衰褪现象。缺点：在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。滤光