芜菁花叶病毒HC-Pro基因的克隆、真核表达及多克隆抗体的制备.pdf

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1、芜菁花叶病毒HDP加基因的克隆、真核表达及多克隆抗体的制备论文作者签名：指导教师签名：速皇丝论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4．评阅人5：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：答辩日期：0nandPoIyclonalicVirus胍-．P阳gene杭州师范大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得揎刿堙菹盘茔或其他教育机构的学位

2、或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解拭刿墟菹盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权揎刿竖范盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：’年月日杭州师范大

3、学硕上学位论文致谢三年的时光转瞬即逝，回首过去心中感慨万千，值得回忆的事情很多，值得感谢的人也很多，感谢这三年来在科研和生活上给我帮助的老师、同学及朋友们，在这里真诚的说声：谢谢!首先，要感谢我的导师施曼玲教授，本研究从内容的选择到实验的设计和实施，从论文的撰写、修改到定稿，都倾注了导师大量的精力和智慧。感谢您对我科研思路上的启发及实验过程中给予的宝贵、中肯的意见和建议，感谢您在生活上给予的无限关心。值此毕业之际，向导师三年来的教诲和关怀表示衷心的感谢!导师严谨求实的科学态度和渊博的专业知识给我留下深刻的印

4、象，使我终生受益。感谢唐斌老师在实验方法及序列分析上的帮助；感谢陈伟老师在实验过程中给予的诸多便利条件；感谢浙江大学刘舟博士实验上的指导，是你们的帮助和支持，使我的论文得以完成。感谢师兄李因来在实验方法上的指导及生活、工作上的关心和帮助；感谢师妹潘熙萍在本论文实施的过程中提出的宝贵建议及实验过程中给予诸多的无私帮助；同时还要感谢师姐高乃波、师妹张丽莎给予的帮助!感谢舍友朱胜男、吴小燕，是你们的热情、真诚、幽默，创造了一个充满快乐的生活及学习氛围，让我在这三年的忙绿实验中痛并快乐着。特别感谢我的家人，感谢你们

5、这么多年来对我学业的默默支持和理解，感谢你们对我无私的奉献；感谢男友多年的照顾、关心和帮助，感谢他在我遇到挫折和困难时给予的鼓励、支持和理解。最后，再次感谢多年来给我关心、支持、理解和帮助的所有老师、同学、朋友及亲人们，谢谢你们!衷心的祝福你们一生平安!杭州师范人学硕：L学位论文摘要芜菁花叶病毒(Tumipmosaicvims，TuMV)是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的一个重要成员，是世界各地广泛分布的重要植物病毒病原之一，主要危害十字花科植物，造成农作物严重减产。TuM[V基因组所编码的HC．Pro蛋白不

6、但与蚜虫传毒、病毒的胞问移动和病症表现相关，而且也是一个病毒沉默的抑制子。本研究克隆了TuMV日D尸加基因，构建真核表达载体TI也O脚C-尸阳，并在本氏烟中获得高效表达，蛋白纯化后作为抗原制备多克隆抗体。Hc．Pro多抗的研制为TllMV病毒的检测，以及HC．Pr0与寄主和病毒的其他蛋白的互作研究打下基础。根据已报道的Tl】MV崩om基因序列，设计两条分别带有PACI和AvIUI酶切位点的引物，通过ImPCR方法，从感染TllM：V的烟草病叶中扩增获得了TuMv日DP阳基因，纯化PCR产物，连接pMD．18

7、T克隆载体，转化EcD，fDH5a菌株，PCR和双酶切鉴定阳性重组质粒并测序。测序结果表明所克隆的TuMV日om基因的序列为1410个核苷酸，编码470个氨基酸，与GellBank上登录的TuMV其他8个分离物((登录号AM410979，AJ831794，AB093609，AJ831799，AB093605，ABl94802，AJ314826，刖438192)的日GP阳基因的核苷酸和氨基酸进行同源性比较，同源率分别为85％一99％和94％一98％。采用内切酶PacI和Aw11分别对重组质粒pMD脚C-m和植

8、物表达载体TRBOpJL50进行双酶切，两者连接并转化E∞，fDH5Q菌株，卡那霉素筛选抗性菌落，经PCR、酶切及测序鉴定，获得了真核表达载体，并命名为TRBOHc．Pr0．将重组质粒TI氇O月D胁导入根癌农杆菌，通过农杆菌浸润接种的方法使月G胁基因在本氏烟叶片中进行高效表达。SDS．PAGE和westemblot分析表明，脚Gm基因在本氏烟中表达所产生的蛋白分子量大小约为53l(Da，与预期大小一致，Ni+．N