基因工程实验报告.doc

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1、基因工程实验报告姓名：杜琳颖学号：学院：生命科学院专业：生化与分子一、实验目的学习并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。二、实验流程实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定一、实验目的学习质粒的酶切及电泳分析。二、实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DN

2、A与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA

3、、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。三、实验材料、仪器及试剂（一）实验材料含载体质粒pET28a的大肠杆菌（二）试剂1、LB液体培养基2、质粒提取试剂

4、盒(天根生物科技)3、TBE缓冲液4、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）5、琼脂糖6、NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)7、DNA回收纯化试剂盒（天根生物科技）（三）仪器1、Eppendorf管、离心管架2、10，50，200，1000μL微量加样器3、Eppendorf台式高速离心机4、电泳仪系统5、恒温水浴箱6、凝胶成像仪7、摇床等一、实验步骤（一）质粒提取1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2、取1.

5、5mL过夜培养的菌液（已备好），加入1.5mL离心管中，使用12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4、向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5、向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3

6、中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7、向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复漂洗一次。8、将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。9、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液

7、收集到离心管中。（二）琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA吸取4μL所提质粒，加入2μLloadingbuffer混匀后点样至0.8%琼脂糖凝胶中，电泳20min左右后拿出放入凝胶成像系统，根据图像判断所提质粒浓度及质量。（三）质粒载体DNA酶切1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中。1、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温5h。2、吸出8μL酶切产物，加入2μLloadingbuffer混匀后点样琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切是否正确，两个酶切位点之间片段大约150bp左右，理论上双酶切电泳应出现两条带，一条较亮的长片段和一条很暗的小

8、片段。而单酶切只出现一条带，即线性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。3、确认酶切正确后，在酶切产物中加入loadingbuffer终止反应，准备胶回