基因工程 实验报告

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1、基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。2实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性

2、，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。2.2PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq

3、DNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。在中温(~72℃)下，通过TaqDNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子6经20轮扩增后，可达10。2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量的原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径

4、的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。SYBRGold与DNA结合的亲和力高，且结合后能够极大的增强荧光信号。SYBRGold染料的最大激发波长为495nm，在300nm有第二个激发峰，其发射的荧光波长为537nm。2.4DNA的体外连接DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。2.5氯化钙制备

5、感受态和转化大肠杆菌原理把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃)的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。2.6蓝白斑筛选重组质粒原理原理lacZ编码β-半乳糖苷酶，受lac启动子调控，当E.coli菌株表达lac阻抑物，则载体上的lacZ基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可以利

6、用X-gal形成蓝色化合物。重组质粒中lacZ插入失活导致不能形成蓝色菌落。3实验试剂及设备3.1实验设备台式离心机、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像检测仪、超净工作台、冰箱、恒温摇床、离心管、移液枪、枪头、冰盒、加样板、量筒100ml、三角瓶500ml、培养皿、锥形瓶150ml、烧杯3.2质粒DNA制备的试剂（1）LB培养基：胰蛋白胨10g，NaCl10g，酵母膏5g，pH7.5，加水1L，高压灭菌。（2）含pBluescriptSK(-)质粒的大肠杆菌。（3）100mg/ml氨苄青霉素水溶液。（4）TE：10mmol/LTris-HCl（pH7.8）—1mmol/

7、LEDTA(pH8.0)。（5）无菌超纯水。（6）溶液II：1%SDS（电泳级）-0.2mol/LNaOH。（7）溶液III：3mol/L醋酸钠溶液（40.8gNaAc.3H2O溶于60mL水中，加入11.5mL冰醋酸，定容至100Ml，高压灭菌，pH4.8。）（8）20mg/mLRNA酶液。（9）水饱和酚。（10）70%乙醇。（11）异丙醇。3.3琼脂糖凝胶电泳的试剂（1）琼脂糖1%（2）加样缓冲液（3）M