基因工程实验报告

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1、基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（geneticengineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的

2、操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。（一）实验过程1.实验部分流程：片段胶的回收小麦幼苗小麦总RNA的提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取表达载体的构建表达菌株转化目的蛋白诱导表达目的蛋白Western杂交检测2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1材料小麦幼苗2.2试剂配制及器具处

3、理①0.1％的DEPCH2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPCH2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。③无RNA酶灭菌水（DEPCH2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。④Trizol⑤75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。⑥氯仿(最好用新的)。⑦异丙醇(最好用新的)。2

4、.3操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5m

5、in。⑤重复步骤④。⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µLDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1试剂①RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤M-MULV反转录酶⑥RNA抑制剂（RNasin）⑦PremixEXTaqDNA聚合酶⑧PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1RNA的反转录采用ThermoScientific（Fermentas）RevertAid

6、FirstStrandcDNASynthesisKitTotalRNA6µL（需加入RNA约1μg）OligodTprimer1µLH2O（nuclease-free）5µL12µL65℃5min，补加下列试剂：5×Reactionbuffer4µLRibolockRNaseInhibitor1µL10mMdNTPMix2µLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase1µL20µL42℃60min70℃，5min，﹣20℃保存3.2.2PCR扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25µL体系）2×PCRMix12.5µL95℃1min35cycles95℃10s58

7、℃20s72℃45s72℃10min16℃∞cDNA1µL引物GA22PDH1-11µL引物GAPDH1-21µLH2O9.5µLtotal25µLPCR产物经胶回收。4．核酸琼脂糖电泳分析4.1试剂①TAE缓冲液（50×）：用时需稀释50倍②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油③溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。④琼脂糖4.2操作步骤4