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《外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备课件.pptx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备,染色体组型分析实验目的1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固
2、定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。人染色体组型及其特征实验材料1.1试验材料:人外周血淋巴细胞1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、载玻片，常规清洗烘干，培养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理，天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、
3、普通冰箱，酒精灯。1.3试剂药品完全培养基凝血素(PHA)5mg/ml肝素0.2％秋水仙素50μg/ml低渗液0.35％KCl固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制Giemsa染液1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制1/15M磷酸缓冲液NaH2PO4&Na2HPO4NaHCO35%（无菌）PH试纸磷酸缓冲液的配制磷酸缓冲液PH4.49--9.18(1/15M)PH甲液X(ml)乙液Y(ml)PH甲液X(ml)乙液Y(ml)4.490106.98644.940.19.97.71735.290.259.757.58825.590.
4、59.57.75915.91198.049.50.56.24288.29.70.36.47378.549.750.256.64468.689.90.16.81559.18100乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含11.864g/L根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.实验步骤1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为:完全培养基3mlPHA20ul肝素一滴用5%NaHCO3调pH到7.2~7.4,分装到10ml的培养瓶中（5ml）,用
5、塞子塞紧,置于4℃条件下保藏。用前从冰箱内取出,放入37℃恒温锅中温育10分钟。选取2培养瓶标记A，B。2采血:医院肘静脉采血200ul，迅速在无菌条件下将肝素化血液滴入至外周血培养基内。3培养:置37℃温箱中培养68~72小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。4秋水仙素处理:终止培养前2—4小时，用移液枪向A加入26ul，B加入39ul。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h。5低渗处理:秋水仙素处理完毕后,小心的从温箱取出培养瓶,将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分钟，弃上清液。然后加入温浴的低渗液1毫
6、升,用滴管轻轻吹打成细胞悬液，补加7ml低渗液。37℃水浴中低渗处理20分钟。6预固定:加入0.5ml固定液（预温37°C），轻轻混匀后1000rpm离心7—8分钟。弃上清液。7固定:每支离心管中,加入固定液3ml,2min后用滴管轻轻冲打成悬液,在室温中固定15分钟后离心,吸弃上清液。8再固定:加入固定液3毫升,用吸管轻轻打散,室温下继续固定15分钟。离心，去上清液。9制片:留固定液0.5毫升,用滴管小心冲打成悬液。从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片,每片滴加悬液1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释
7、后的姬姆萨染色液染色20分钟,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗.12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高倍油镜观察。实验结果核型分析表核型分析步骤：讨论接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24小时内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力.在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要.人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃.培养液的最适pH7.2~7.4.制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开,可
8、将固定时间延长数小时或过夜.
