羊水细胞培养及染色体标本制备的方法探讨

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1、羊水细胞培养及染色体标本制备的方法探讨王珍张海平高亮亮（内蒙古乌海市妇幼保健院检验科016000）【摘要】目的：探讨羊水细胞培养及染色体标木制备的方法.提高羊水细胞培养及染色体标木制备的成功率。方法：正常羊水4-8ML不离心直接接种,37°C,5%CO2培养，换液后的标木不再另加培养基直接37°C,5%CO2培养,6天后观察，根据细胞的牛.长情况及时收获。染色体标木制备用消化法。结果:培养成功率99%（130/131）,最小孕周14+6周，最大孕周32周.染色体分裂相较多，且带纹多而清楚。结论：减化了接种的步骤，减少了污染的机会，同时避免离心对细胞的破

2、坏，提高了培养成功率。【关键词】羊水细胞培养染色体【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）10-0012-02羊水细胞培养及其染色体制备技术是胎儿染色体病产前诊断的重要手段。羊水细胞培养技术要求高，羊水中活细胞少，培养周期长，易污染，分裂相少;涉及细胞的培养，收获，低渗，固定，显带，染色等诸多环节，任何一环节不合适都可能导致失败.针对这些情况，借鉴别的实验室的经验,结合木实验室的条件，我们摸索出了一种简便易行的方法，收到了良好的效果，现报告如下。1实验原理人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特

3、征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短，AF细胞在培养初期就长得很好、染色体分析大多用这类细胞。F细胞在培养中的生长期最忪，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3-4天（可能更早些）即出现E细胞的集落他们不适合做染色体。大约在第7天出现的AF细胞可用于染色体制备。2器材与试剂2.1C02培养箱SHELLAB2306水套式（美国产），CK41组织培养用倒置显微镜（H本产），超

4、净工作台（国产）。2.2试剂:BI0-AMF-3（或2）培养基:以色列生产。10ug/ml秋水仙素：自配，0.5%胰酶：自配。Giemsa漿液：自配。0.4%枸橼酸钠溶液：自配。0.4%KCL溶液：自配3羊水细胞接种和培养3.1接种羊水标本之前准备工作环境准备：打开无菌间、超浄工作台内紫外线灯消毒30分钟，开抽风系统、空调。人员准备：进入无菌间前在衣帽间换鞋、穿隔离衣、戴口罩、帽子、手套。物品准备：一次性无菌培养瓶、一次性注射器、己解冻复温的羊水培养基。3.2釆样：⑴采集的对象是经产前筛查评估结果为高风险发病率的孕妇或有其他产前诊断指征的孕妇或准备引产

5、的孕妇，孕周在14-32周+6天.⑵在羊水穿刺室，孕妇在手术床上来回翻身8次左右，在B超引导下抽取羊水12-20ml,最初用5M注射器抽取2ML弃去，在换20ML注射器抽取12ML-20ML,迅速送到接种间。3.3接种：将注射器内的羊水混匀。净化工作台内无菌操作，平均接种于3个25Cm2细胞培养瓶（每瓶中4-6ML羊水）,另外每瓶加入3.5-4ml羊水培养液。3.4培养：酒精灯过火瓶口，旋松瓶盖卧式静置于37aC、5%CO2培养箱中，培养6天后观察细胞贴壁及生长情况。3.5细胞培养情况观察：细胞培养6天后方可在倒置显微镜下观察：3.5.1瓶底面冇人量羊

6、水细胞生长（4-6个克隆），人而亮圆的分裂期细胞多，每个圆形细胞饱满，边缘清晰，胞核清楚，内含丝状物，细胞肿胀似阿米巴原虫伸出的伪足，象要破裂似的，有的圆形细胞透亮成双成对，此吋羊水细胞可以收获。收获前视细胞生长情况更换新鲜培养液。3.5.2见瓶底面奋较多克隆的细胞生长，但细胞较稀薄，估计在培养后其生长会更旺盛，可换液：无菌操作将3个培养瓶内液体分别倒入另外3个新的培养瓶内，不加培养基继续培养。在原培养瓶内加入4.0ml己复温的羊水培养液，培养1-2天，待镜下见到较多大而圆的分裂期细胞即可收获。3.5.3贴壁生长的细胞克隆很少或没奋，应积极寻找原因，调

7、整培养体系，认真细心收获已贴壁生长的细胞，不能轻易放弃！4终止培养加秋水仙素（浓度lOug/ml）4滴（注射器7号针头），最终浓度为0.06-0.08ug/ml轻轻混匀，旋松瓶盖卧式静置于37°C二氧化碳培养箱内作用1.5小吋。5羊水细胞收获制片（方法为胰酶消化法）5.1将培养液吸入一个干净离心管中离心1500转离心2分钟，待用。5.2在培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶（37°C）2ml,立即放入37°C培养箱中温育5分钟（快速操作！避免培养瓶和胰蛋白液等温度降低，影响胰酶活性和消化效果）。取出轻轻摇动，用吸管吹打，待细胞全部脱落后，将离心好的培养液加入

8、培养瓶，继续用吸管吹打瓶壁以便收集到更多的分裂细胞。将瓶中细胞悬液转移到离心管中，1500rp