荧光定量PCR的原理和应用课件.ppt

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1、PCR的原理和应用体内DNA复制的过程类似于DNA的天然复制过程：1.半保留复制2.半不连续合成:一条链是连续合成的(前导链leadingstrand),而另一条链（随从链，laggingstrand）是不连续合成的：冈琦片段。3.合成过程：3.1合成起始a.螺旋的松弛与解链:拓扑异构酶;解链酶（helicase）,单链结合蛋白（SSB）b.引发：引物酶（primase）以DNA为模板，自5‘→3’合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸。引发前体（preprimosome）㈡DNA链的延长反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+反应式：DNA+dNTP

2、→（DNA）n+1+ppiDNA聚合酶：催化5‘→3’DNA合成；3‘→5’外切酶活性：去除错误碱基，有校对作用；5'→3'外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。㈢终止连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3',5'磷酸二酯键相连，需ATP供能。PCR技术的基本原理PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：93℃-96℃②模板DNA与引物的退火(复性)：50℃-68℃③引物的延伸：60℃-75℃35-40循环。PCR反应体系1.DNA模板2.dNTPs3.引物4.taq酶5.mg2+6.反应缓冲液（保持一定的PH值）影响PC

3、R的因素1.引物引物决定了：扩增片段的大小扩增片段的特异性引物设计的注意事项2.DNA模板纯度、浓度3.taq酶酶的活性4.mg2+离子浓度5.缓冲液的PH值RT-PCR通过逆转录酶的作用，将RNA逆转录为cDNA，再通过PCR扩增得到大量的cDNA双链以便分析。RT-PCRPCR动力学S型曲线指数增长期平台期TealtimePCR原理TAQMAN探针淬灭基团：报告基团：Real-timePCR的应用一：病原体二：遗传病三：基因表达