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《杜雾晨--高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过
2、肽键结合而成。多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋
3、化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术范围内一有力
4、高效的分离工具[2]。1多肽的合成1.1多肽合成的分类多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。在合成含有特定顺序的多肽时，由于合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体，合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了合成目标产物的定向性。多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。片段组合法[3]主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽
5、和蛋白质合成领域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根据多肽片段的化学特定性或化学选择性，多肽片段能够自发进行连接，得到目标多肽。因为多肽片段含有的氨基酸残基相对较少，所以纯度较高，且易于纯化。1963年，美国著名生物化学家Merrifield提出了固相合成法，开展了多肽固相合成，即将氨基酸的C末端(羧基端)连接在不溶树脂上，然后在此树脂上依次进行氨基酸的缩合、延长肽链。固相合成方法可分为叔丁氧羰基(Boc)方法和9-芴甲基氧羰基(Fmoc)方法[4]。人们以多肽的液相和固相合成方法为基础又发展了氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、组合化学法等
6、。多肽的生物合成方法主要包括发酵法、酶解法，随着生物工程技术的发展，以DNA重组技术为主导的基因工程法也被应用于多肽的合成。1.2多肽的固相合成Merrifield创建并发展了多肽的固相合成方法之后,多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性,应用这一神奇的方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。其基本原理如下图所示:图1多肽的固相合成原理多肽的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端(氨基端)进行合成。多肽固相合成的原理是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成
7、起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。显然,用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满个条件:一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上,然后从氨基端逐步增长肽链;二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护,反应完成后再将保护基团除去;三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化[4]。1.2.1聚合物载体和连接分子考虑到固相合成多肽的特殊性,用于固相合成多肽的载体在合成条件下应是惰性的
8、、不溶性的交联聚合物,并能够对单体中活性基团进行选择性保护和去保护;连接反应物到载体上的方法应便于在合成过程中分析反应过程且最后给出目标物时,可以选择性地从载体上裂解下一部分或全
