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1、迪康金诺NGS应用交流会宏基因组研究在肠道微生物中的最新研究应用报告人：樊玉才2014.06组织单位：江苏省水产动物营养重点实验室南京迪康金诺生物技术有限公司1大纲什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用2什么是宏基因组研究？无需培养，直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,结合高通量测序来研究样品中的微生物组成及群落功能。3宏基因组研究热点MetaHIT•MetagenomicsofHumanIntestinalTract•人类肠道宏基因组计划•HMP•HumanMicrobi
2、omeProject•人类微生物组计划•GOS•GlobalOceanSamplingexpedition•全球海洋调查•EMP•EarthMicrobiomeProject•地球微生物计划4宏基因组研究的分析流程提取环境样本DNA获取测序数据生物信息学分析5提取环境样本DNA宏基因组测序:•浓度≥50ng/ul;PowerWater®DNAIsolationKit•OD260/280:1.8-2.0;•DNA两次需要量:≥3ugPowerSoil®DNAIsolationKitPowerFecal®
3、DNAIsolationKit6生物信息分析（一）数据质控对测序数据的客观评价数据质量GC含量1)去除接头污染和低质量数据2)去除宿主污染7生物信息分析（二）：物种组成(16S/18S/ITS)121:物种丰度2:样本聚类8生物信息分析（二）：物种组成(16S/18S/ITS)多样性曲线PcoA分析9生物信息分析（三）基因功能分析代谢通路分析10生物信息分析（三）基因功能分析COG注释CAzyme注释11生物信息分析（四）个性化分析1)筛选与样品分组显著相关因子(基因、功能)2)基于筛选因子对样品进行
4、主成分分析(PCA)3)基于筛选因子对样品进行聚类分析（组数≥2,每组样品数≥10)12大纲什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用13研究案例（一）Science：牛胃中微生物酶可用于开发生物燃料背景：纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物资源。牛在反刍过程中涉及到纤维素的分解，研究牛的消化机制，有利于寻找应用于生产生物燃料的酶。14研究思路瘘管奶牛将柳枝稷样品置于牛的瘤胃中培养72小时，然后对附着在柳枝稷样品上的所有微生物进行基因组分析。IlluminaGAIIx＋Illumin
5、aHiSeq2000测序建库：200,300,3k,5k双端测序：2*125、2*200、2*7515研究结果总共识别了27,755与碳水化合水物绑定模块或具有催化功能的候选基因16后续实验选取233个候选基因，通过设计特定引物，然后使用PCR扩增，其中158of233(68%)得到了扩增产物。随后将扩增产物通过载体（选择90个候选基因）导入大肠杆菌，然后由这些细菌产生了90种蛋白质酶，其中51of90(57%)具有酶活性17研究案例（二）：宏基因组和宏转录组背景：反刍动物排放的CH4是温室气体的重要
6、来源之一羊排放的甲烷气体量存在差异性应用宏基因组与宏转录组测序发现两18组之间是否存在差异性研究思路样本收集：4highest,4lowest,and2intermediateCH4yieldstwoseparatetimes(20samplestotal)高通量测序：SSUrRNAgenesequencing：454pyrosequencing测序：IlluminaHiSeq2000insertsizeof250bp、8kb2×150bppair-end19研究结果应用宏基因组分析，没有发现物种差异
7、性20宏基因组vs宏转录组(A)CO2/H2甲烷生成代谢通路.(B）基因丰度.(C)转录本表达差异.（D）转录本种类差异分析；RPM,readspermillion.NS,nostatisticalsignificanceinWilcoxonrank-sumtest;*,P<0.05;**,P<0.01;Errorbarsdenotestandarderrors.21研究案例（三）Gut：运动可能增加肠道菌群多样性背景：研究表明，肠道菌群多样性的减少与肥胖及其他健康问题相关，而肠道菌群多样性的增加则有
8、利于新陈代谢和免疫。运动可能对肠道菌群的多样性产生有益影响。Clarke,S.F.,etal.,Exerciseandassociateddietaryextremesimpactongutmicrobialdiversity.Gut,2014.22研究思路平均身体质量指数（BMI），用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身体质量指数（BMI）是29.1样本收集：40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名则属于高BMI组（
