基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第10期2015年10月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1513～1519DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150453基于A核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测陈佳郭芸芸陈桥邱洪灯¨(中国科学院兰州化学物理研究所西北特色植物资源化学重点实验室／甘肃省天然药物重点实验室，兰州730000)(西南交通大学材料科学与工程学院，材料先进技术教育部重点实验室，成都610031)摘要基于G一四链体／血

2、红素DNA酶的高催化活性以及A核酸外切酶(hexo)的辅助放大功能，以17个碱基的DNA片段作为模型分析物，构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol—H02-G-四链体／血红素DNA酶化学发光传感体系。考察了Aexo用量、Luminol浓度、H0浓度、溶液pH值对体系化学发光强度的影响。在最佳实验条件下，即：pH=9．0，10unitsAexo，1．0x10mol／LLuminol，3．0×10mol／LH202，测得DNA在2．0×10。8．0x10mol／L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间

3、呈现良好的线性关系，检出限(30-)为0．7x10mol／L。本方法可以区分不同错配的核酸序列，并可用于复杂生物样品的分析。关键词A核酸外切酶；G-四链体／血红素DNA酶；化学发光；DNA1引言DNA是生物体遗传信息的载体J，构建快速、灵敏、高选择性的生物分析新方法用于低丰度的DNA序列的检测在临床诊断、基因筛选、食品和环境监测、国土安全等方面起着至关重要的作用J。近年来，信号放大已经成为提高DNA检测灵敏度的重要手段，如采用纳米材料作为信号放大的标记物、采用聚合酶链反应(PCR)或者滚环扩增(RCA)等核酸扩增技术等。

4、虽然这些方法大大提高了检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐、费时、价格昂贵、易出现假阳性信号等缺陷J。使用限制性内切酶进行信号放大的方法，较以往的信号放大方法更为简单、快速，但是由于限制性内切酶只能针对特定的DNA序列，在实际应用中存在一定的局限性’。因此，发展快速、灵敏的DNA测定新方法具有重要的理论和实际意义。A核酸外切酶(Lambdaexonuclease，Aexo)是一种高持续性核酸外切酶，能够催化双链DNA分子自5磷酸末端一3方向逐步水解，并释放出5一单核苷酸，进而将双链DNA变成单链DNA’Ⅲ。Aexo在核酸重组

5、、复制、分型、基因修复以及分子克隆等方面起着至关重要的作用，已成为研究基因组成、功能及表达的重要工具之一。此外，许多研究者将Aexo的独特性质应用于核酸探针的信号放大技术，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测_l卜HJ。但是这些方法大多需要对核酸探针进行荧光标记，过程复杂且成本较高。G一四链体／血红素DNA酶(G—Quadruplexes／heminDNAzyme)是一种具有催化性能的人工模拟酶，由富含鸟嘌呤碱基的核酸分子与血红素结合，形成稳定的G．四链体结构，表现出类似于辣根过氧化物酶的涪眭，能够催化H0：氧化2，

6、2一联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)产生颜色变化或者催化H0氧化鲁米诺(Lumino1)产生化学发光¨”J，在生化分析领域已经引起研究者的广泛关注。化学发光(Chemiluminescence，CL)分析由于不需要激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，大大提高了信噪比，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单等优势，目前已广泛应用于免疫分析、临床检验、环境检测、物质分析等领域_1。本研究采用3条核酸链构建DNA夹心结构，使用Aexo进行目标DNA的辅助放大，建立了新型化学发光传感器，成功

7、实现了DNA检测。本方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优势，可用于实际样品分析。2015-05-29收稿；2015-08-08接受本文系国家自然科学基金(No．21405163)以及甘肃省科技计划(No．145RJYA271)资助E—mail：hdqiu@licp．cas．cn1514分析化学第43卷2实验部分2．1仪器与试剂LS-55型发光光度计(美国Perkin—Elmer公司)；PHSJ-4A型pH计(上海精密科学仪器有限公司)。所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供(序列见表1)。Luminol、H：O(

8、国药上海试剂公司)；血红素(Heroin)、Ⅳ_2一羟乙基哌嗪-Np-2-乙磺酸(HEPES)购于美国Sigma公司；A核酸外切酶(Lambdaexonuclease，Aexo)、10xAexo反应缓冲液(0．67mol／LGlycine．KOH(pH9．4，25oC)，0．02mol／LMgC1，500mLBSA)