农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素.doc

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1、二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti质粒。发根农杆菌含有Ri质粒。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒都具有一段转移DNA(transferDNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到甚至150

2、kb的外源基因，因此，Ti质粒和Ri质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。1与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti质粒上T-DNA以外Vir区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD蛋白可能在低pH和磷酸饥饿情况下提高VirG蛋白的合成水平。ChvE与VirA蛋白共同对virG起激活作用。原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T-DNA区：是在农杆菌

3、侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。

4、（3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。（4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区

5、基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。2Vir基因的诱导表达机制在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。当农杆菌接受到此类信号时，其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体

6、蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域，从而成为其它vir基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。ChvE可大大增强vir基因被As诱导的效果，ChvE可结合一些单糖，也可直接与VirA周质区相互作用，以加强As对Vir基因的诱导。3T-DNA复合物的形成T-DNA的加工与转移是由Vir基因被诱导后产生的

7、蛋白完成。VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。VirD1蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA。VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA的内切酶活性，它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24bp重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA从Ti质粒上剪切下来，称为T-strand或T-链。切开T-DNA后，VirD2蛋白与T-链的5，端共价结合，避免核酸外切酶降解T-链。新的T-DNA底链以此链为模板，从右端产生的DNA缺口处以5’-3’方向进行合成。被取代的旧链游离出来

8、，与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。4T-DNA复合物的跨膜转运农杆菌的T-DNA转移通道由多达1