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时间:2020-05-25
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1、小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 [08-10-3013:48:00] 作者:吴建芳 编辑:studa20【摘要】 目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快,细胞纯度达98%以上,足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济,试验成功率高,节省材料和时间,而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳(1972~),女,汉族,青海籍,副教授,硕士【关键词】 小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养 Abstract Objec
2、tive Tocreateasimpleandeffectiveprimaryculturemethodsformousevascularsmoothmusclecells(VSMC). Methods Reformedenzymaticdigestion.ResultsVSMCwasgrownwellandfast,thepurityismorethan98%whichcanmeetvariouscelltests.Conclusion Comparingwithtraditionalmethods,this
3、approachescansavemuchtimeandmorematerials,alsohavebettercellquantitiesandpurity. Keywords Mouse AortaVSMC Primarycult 在心血管疾病的基础研究中,对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分,其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型,近年来随着细胞培养技术的发展,原代培养的成功率有所提高,但仍然存在许多问题,经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索,不但影响试验进
4、程而且浪费材料,而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的,所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率,并在有限的材料下获得好的结果,我们大胆采用了酶消化法(常规采用组织块培养法),从取材方法及消化步骤等方面进行了改良,试验结果证实该法简单经济,成功率高,细胞生长快,纯度高,现介绍如下。 1 材料与试剂 1.1 组织来源:C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 1.2 试剂:鼠抗SMC-α-actin,Cy2conjugatedaffinitypurifiedanti-mouse IgG[H/L],戊
5、巴比妥钠注射液。 1.3 培养基:在DMEM培养基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、链霉素、1%谷氨酰胺,过滤除菌备用(不要超过四4周)。 1.4 酶消化液:CollagenaseTypeⅡ7mg溶于5mlDMEM培养基中(无血清),过滤除菌即用。 1.5 70%乙醇:用无菌蒸馏水配制。 1.6 器械、仪器:齿、平镊,组织、眼科剪,无菌注射器,培养皿,解剖显微镜(Paxcam,Vistavision),荧光显微镜(LEICADMI6000B)。 2 方法 2.1 常规麻醉小鼠,70%乙醇
6、冲洗颈部和腹部,打开胸、腹腔,暴露心脏。 2.2 5mL注射器穿刺左心室,PBS缓冲液冲洗主动脉。 2.3 完整分离主动脉,放入100mm无菌平皿,滴1~2滴PBS缓冲液。 2.4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明(如粗糙不平说明外膜去除不干净)。 2.5 取出血管,放入另一有PBS缓冲液的平皿里,转到超净工作台操作。 2.6 眼科剪将血管快速剪成1~2mm2 大小后用胶原酶消化3~4h(组织块变成细胞团即可)。 2.7 加入DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液,离心管中加入1ml
7、新鲜培养基重悬细胞,接种于12孔培养板中的一孔,常规静置培养。 2.8 第2天观察是否有细菌污染,如有要更换新鲜培养液,静置培养。于第5、6天细胞生长达培养皿面积的80%左右时可传代,常规方法即可。
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