氯喹在诱导肝癌细胞死亡中的作用机制研究.pdf

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1、中国临床医学2015年4月第22卷第2期ChineseJournalofClinicalMedicine，2015．Vo1．22，No．2135·论著氯喹在诱导肝癌细胞死亡中的作用机制研究丁振斌史颖弘彭远飞宋康周俭樊嘉(复旦大学附属中山医院肝外科，上海200032)摘要目的：研究自噬抑制药物氯喹(chloroquine，CQ)诱导肝癌细胞死亡的作用机制，探索自噬相关药物可能的临床应用价值。方法：选取3种肝癌细胞系，给予不同浓度CQ干预24h，采用MTT法检测细胞的增殖情况，采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞死亡，采用Hoehest33342染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(

2、TUNEL)染色、Westernblotting(caspase一9)法检测凋亡。采用GFP—LC3转染、Westernblotting(LC3)及细胞电镜技术检测细胞自噬功能。结果：MTT检测显示，CQ作用24h能够显著抑制肝癌细胞增殖。CQ(≥20／xmol／L)干预后，PI染色阳性细胞明显增多，Hochest33342核染色显示核浓聚、核碎裂，TUNEL染色阳性细胞明显增多，caspase一9活化；而CQ(5、10“mol／L)干预后PI染色阳性细胞数目无明显变化。cQ处理细胞后，GFP—LC3阳性细胞明显增多，LC3一II蛋白表达明显增高。同时用caspase抑制剂Z—VA19-FMK

3、和3-MA或沉默Atg5的表达预处理，可显著抑制40umol／LCQ诱导的MHCC97一L细胞的死亡。结论：cQ可以抑制肝癌细胞自噬降解，导致自噬小泡及自噬标志性蛋白积聚。大剂量CQ直接诱导肝癌细胞死亡，其死亡形式既具有凋亡的特征又具有自噬样死亡的特征。关键词自噬；肝细胞肝癌；凋亡；氯喹中图分类号R735．7文献标识码AMechanismResearchonDeathofHepaticCarcinomaCellsInducedbyChloroquineDINGZhenbinsHIYinghongPENGYuanfeiSONGKangZHoUJianFANJiaDepartmentofLiver

4、surgery．ZhongshanHospital，FudanUniversity，Shanghai200032，ChinaAbstractObjective：Toinvestigatetheroleofchloroquine(CQ)duringinducingthedeathofhepaticcarcinomacellsandtoexploretheclinicalapplicationofautophagy-relatedagents．Methods：ThreekindsofhepaticcarcinomacelllineswerechosenandtreatedwithCQatdiffe

5、rentconcentrationsfor24hours．ThenMTTassaywasappliedtodeterminetheproliferation，andprodiumiodide(PI)stainingassaywasusedtodetectthecelldeath．ThespecificapoptosiswasexaminedbyHochest33342staining，TUNELstainingandWesternblotting(caspase一9)．TheautophagicfunctionwasexploredbyGFP-LC3redistribution，Western

6、blotting(LC3)，andelectronmicroscopy．Results：MTTassayrevealedthattheproliferationofhepaticcarcinomaceilswassignificantlyinhibitedbyusingCQfor24hours．ThePI—positivecellsincreasedsignificantlyafterthetreatmentwithCQ(≥20#mol／L)．Hochest33342stainingassayshowedkaryopyknosisandkaryorrhexis．Meanwhile。TUNELp

7、ositivecellssignificantlyincreasedandcaspase一9wasactivated．However，therewasnosignificantchangeinthenumberofPI—positivecellsaftertheCQtreatmentatconcentrationsof5“mol／Land10mol／L．CQtreatmentresultedins