大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化.pdf

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1、江苏农业科学2015年第43卷第4期一53一代军．大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J]．江苏农业科学，2015，43(4)：53—54doi：10．15889／j．issn．1002—1302．2015．04．017大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化代军(辽宁民族师范高等专科学校，辽宁阜新123000)摘要：针对大肠杆菌(Escherichiacoli)DI-ISc~，以pGM—T、pMD一18T为载体，在传统CaC1：方法的基础上，对制备及转化条件进行了改进和优化，结果表明，42℃热激的最佳时间为10

2、0s，最适冷却时间为6～8min。本研究将常规的50mL离心管改成了1．5mLEP管，有效降低了分装过程中可能产生的污染风险，简化了试验程序，提高了转化效率。关键词：基因克隆；大肠杆菌；感受态细胞；转化条件；改进；氯化钙法中图分类号：Q一331文献标志码：A文章编号：1002—1302(2015)04—0053—02大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是分子生物学试验中压蒸汽灭菌，4℃保存备用。100mS／'mL氨苄青霉素(Amp)：一项重要的常规操作技术，可用于基因克隆、文库构建等研取1gAmp溶于100mL无菌水

3、中，分装至2mLEP管中，滤究⋯。携带目的基因的重组质粒能否导入受体细胞，进而得膜过滤，一2O℃保存备用。LB培养基：胰化蛋白胨10．0g，以复制、增殖、表达，感受态细胞质量及转化条件是关键因酵母提取物5．0g，NaC110．0g，琼脂粉14．0g，溶于950mL素J。目前，商业公司可为分子生物学试验提供各种感受态无菌水中，用5mol／LNaOH调节pH值至7．0，定容至1L，高细胞，但存在价格昂贵、运输途中容易导致感受态细胞解冻等压蒸汽灭菌。分装至培养皿。问题。。大部分实验室仍采用经典的氯化钙法自行制备感1．

4、3．3菌种活化将DI-15ct菌种在LB固体培养基平板上受态细胞。大肠杆菌菌株DH5ct是实验室常用的宿主交错划线，37℃过夜培养，获得良好单斑。取无菌试管加入菌，常被用于基因克隆、原核表达研究。氯化钙转化方法具有2mLLB(不含抗生素)培养基，挑取良好单斑接种于试管中，操作简单、重复性好、转化率高等优点，其原理是ca“破坏细37℃摇床培养过夜。按1：100的比例，取0．5mL菌液转接胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机至含有50mLLB液体培养基的三角烧瓶中，37℃摇床培养磷酸形成复合物以利

5、于外源DNA渗入。不同菌株、不同2～3h，直至D600值达0．4左右。实验室环境对于感受态细胞制备及转化条件影响不同，因此1．3．4大肠杆菌DHSa感受态细胞的制备将菌液分装至有必要针对特定菌株对其感受态细胞制备、转化条件进行优预冷无菌的1．5mLEP管中，于冰上放置10min，4℃化。本研究探讨该菌株感受态细胞制备以及转化的最优条4000r／rain离心10min。将离心管倒置以倒尽上清液，用移件，旨在为后续分子生物学研究提供依据。液枪将倒不尽的上清液吸出，加入1mL0．1moVL冰冷CaC1：溶液，立即在漩

6、涡混合器上混匀，冰上放置30min。4℃1材料与方法4000r／min离心10rain，弃上清液，倒置1min，加入1mL1．1材料0．1mol／L冰冷CaC1溶液，移液枪轻轻吹打垂悬细胞，冰上放大肠杆菌菌株E．coliD由笔者所在实验室一7OqC置30min。4℃4000r／min离心10rain，弃上清液，倒置保存。载体pGM—T、pMD一18TVector购于天根生化科技1min，每管中加入60L冰冷0．1mol／LCaC1垂悬细胞，冰(北京)有限公司、大连宝生物公司。0．1mol／LCaC1：溶液所上放

7、置2h，即可用于转化；也可加入体积分数为40％的甘用无水CaC1：为国产分析纯。氨苄青霉素(ampicillin)购于天油，一7O℃超低温保存备用。根生化科技(北京)有限公司。1．3．5质粒转化将5质粒DNA直接加入100mL感受1．2仪器态细胞中，手指轻弹管底部混匀，冰浴30min。42oC水浴热HITACHISCR20BA高速冷冻离心机，HH一6数显恒温激，设置20、30、40、60、80、90、100、120s8个时间梯度，设水浴锅，MP200A分析天平，Eppendorf移液器，超净工作台。置2-,4、

8、6、8min4个冰浴冷却时间。加人900LB液体培1．3方法养基(不含抗生素)，37℃180r／min振荡培养1．0—1．5h。1．3．1准备工作EP管、枪头、枪头盒、100mL三角瓶、培取上述转化混合液100，滴到固体LB平板培养皿(含抗生养皿等进行高压蒸汽灭菌，100℃烘干，一20℃冷冻备用。素100g／mLAmp)中，用玻璃涂布棒涂布均匀。正面向上1．3．2药品配制0．1mol／