红豆杉免培养内生细菌多样性的初步研究-论文.pdf

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1、微生物学通报May20，2013，40(5)：766—774MicrobiologyChina◎2013byInstituteofMicrobiology．CAStongbao@im．ac．cn红豆杉免培养内生细菌多样性的初步研究张晶晶兰阿峰1,2邓百万，陈文强1,2孔亚男(1．陕西理工学院生物科学与工程学院陕西汉中723001)(2．陕西省食药用菌工程技术研究中心陕西汉中723001)摘要：【目的】了解红豆杉(Taxuschinensis)内生细菌的组成及多样性。【方法】提取红豆杉组织总DNA选

2、用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16SrDNA特异性扩增，构建红豆杉肉生细菌16SrDNA克隆文库，对阳性克隆进行PCR—RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)分析，并对酶切带谱不同的菌液进行测序，构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果的不同，将随机挑取的l58个阳性克隆归为26个不同的可操作分类单元(0uTs)，系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌f](Proteobacteria，包含Alpha、Beta、Gamma、Delta亚群1、厚壁菌门(Firmicu

3、tes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个门。其中，变形菌门(Proteobacteria，占克隆总数的58．86％)为最优势类群。序列比对结果表明这些克隆序列分别与已报道的2O个属具有较高的相似性。此外，还有一个OUTs在系统发育树上形成独立分支且未能确定其分类。【结论】红豆杉内生细菌多样性丰富，并且可能存在新的分类单元。关键词：免培养，红豆杉，内生细菌，多样性基金项目：陕西省重点实验室项目(No．08JZ21)；陕西省教育厅项目(No．08J

4、K248，08JK244)通讯作者：圜：Dengbw2008@yahoo．corn．cn收稿日期：2012-07—26；接受日期：20l2一l0—09张晶晶等：红豆杉免培养内生细菌多样性的初步研究767Culture--independentanalysisofendophyticbacterialdiversityinTaxuschinensisZHANGJing．JingLANA—FengDENGBai．Wan，CHENWen．QiangKONGYa．Nan(1．SchoolofBiologi

5、calSciencean(1Engineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong，Shaanxi723001，China)(2．ShaanxiEngineeringResearchCenterofEdibleandMedicatedFungi，Hanzhong，Shaanxi723001，China)Abstract：【Objective】Weinvestigatedthecompositionanddiversityofendophyticbact

6、erialinTaxuschinensis．【Methods】ThecompositionanddiversityofendophyticbacterialinTaxuschinensiswereanalyzedbyculture—independentmethod．Whentota1communityDNAwereextracted．apairofbacterialPCRprimerswereusedforendophyticbacterial16SrDNAgeneamplificationan

7、daclonelibrarywasconstructedfortheTaxuschinensisDNAsamples．Posi—tivecloneswereanalyzedbyPCRrestrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR—RFLP)andthecloneswithuniquepatternswereselectedforsequencingandconstructing16SrRNAgenephylogenetictree．【ResultsJBasedo

8、nHaeIIIdigestionandsequencingresult，atotalof158positiveclonesthatrandomlyscreenedfromthelibrarywerefal1into26operationaltaxo—nomicunits(OTUs)．Theseclonesquencesweredividedinto4phylawithphylogeneticanalysiswhichconsistedofAlpha，Beta，Gammaanddel