DB37T 3320-2018 水貂、狐和貉常见细菌实时荧光PCR检测方法.doc

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1、ICS 65.020.30B41     DB37山东省地方标准DB37/T3320—2018     水貂、狐和貉常见细菌实时荧光PCR检测方法Real-timefluorescentPCRfordetectingofcommonbacterialpathogensofmink、foxandraccoondog2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局   发布DB37/T3320—2018前  言本标准按照GB/T1．12009给出的规则起草。本标准的附录为资料性附录。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本

2、标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院。本标准主要起草人：王贵升、张鹤晓、王金宝、田夫林。5DB37/T3320—2018水貂、狐和貉常见细菌实时荧光PCR检测方法1　范围本标准规定了水貂、狐和貉常见细菌（大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌、不动杆菌）实时荧光PCR检测方法。本标准所适用于水貂、狐和貉的常见细菌的快速筛查和检测，其他动物细菌可参考本标准。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单

3、）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3　缩略语荧光定量PCR荧光定量聚合酶链式反应。Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数。DNA脱氧核糖核酸。Taq酶TaqDNA聚合酶PBS磷酸盐缓冲生理盐水4　试剂和材料4.1　荧光定量PCR检测仪及配套反应管（板）。4.2　高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.3　混匀器。4.4　恒温水浴锅。4.5　冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）。4.6　微量移液器（0.5L～10L，5L～20L，

4、20L～200L，200L～1000L及配套吸头。4.7　1.5mL离心管（无核酸酶）。4.8　可以选用经验证效果好的细菌DNA柱式提取试剂盒，或按照附录A配制试剂。5　样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。5.1　取样工具5DB37/T3320—20181.1.1　棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。1.1.2　所有上述取样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。1.2　采样方法1.2.1　拭子样品咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。肛拭子采

5、样，采样时要将拭子深入肛门回刮3次～5次，取排泄物。1.2.2　内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。1.2.3　血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。1.3　运送与存放采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。2　引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”。表1　荧光PCR方法的引

6、物及探针大肠杆菌FGTGTGATATCTACCCGCTTCGCRAGAACGGTTTGTGGTTAATCAGGAProbeFAM-TCGGCATCCGGTCAGTGGCAGT-MGB克雷伯氏菌FTGAAACGACCTGATTGCATTCGATRAGGCTGTCGGGATAAGCCAProbeHEX-CGCGCCACYGGAAGGGYATG-TAMRA绿脓杆菌FACCCGARACGYAGGCTATGRCAGGTCGGAGCTGTMCTACTCProbeFAM-AGGTGGTGATCGCACGCAG-BHQ沙门氏菌FGCCATGCTGTTCGATGATRGTTACCGATAG

7、CGGGAAAGGProbeFAM-TTTTGCACCACMGCCAGCCC-TAMRA嗜水气单胞菌FGCCGTCGAAACCAACGTAGARCAACACCTGGTCCGGTATCGPFAM-CAGCAGAAACTTGCCACTCGGTCTTG-BHQ1不动杆菌FGTTGTGGCTTTAGGTTTATTATACGRAAGTTACTCGACGCAATTCG5DB37/T3320—2018表1　荧光PCR方法的引物及探针（续）不动杆菌ProbeCY5-ACCCATCAAGGTAAAGGCTTCGTTCG-BHQ1柠檬酸杆菌FTT