柠条锦鸡儿香豆酸-3-羟化酶基因克隆及其功能初步研究-论文.pdf

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2013，33(4)：61-67柠条锦鸡儿香豆酸-3-羟化酶基因克隆及其功能初步研究木李高杨杞张烨。王瑞刚李国婧(1内蒙古农业大学生命科学学院呼和浩特0100182北京市颐和园管理处北京100091)(3鄂尔多斯市食品药品检验研究中心鄂尔多斯017000)摘要香豆酸-3-羟化酶(Coumarate3一Hydroxylase，C3H)是木质素生物合成途径中的关键酶之一。以柠条锦鸡儿为材料，利用RACE技术克隆了C3H基因。对柠条锦鸡儿C3H基因的gDNA和cDNA全长分析显示该基因具有3个外显子，2个内

2、含子，编码框长度为1530bp，编码509个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点位7．67，分子量约57．61kDa。氨基酸序列分析显示具有一个保守的P450结构域。系统进化分析表明该蛋白与大豆C3H具有最高的同源性，将该基因命名为CkC3H，GeneBank登录号为HQ829858。构建了35S启动子驱动的CkC3H基因植物表达载体，互补拟南芥C3H(CYP98A3)基因突变体ref8，转基因植物表型得以部分恢复。这些结果说明柠条锦鸡儿CkC3H与拟南芥C3H至少具有部分相同的功能。关键词C3H木质素序列分析refS中图分类号Q786木质素是植物中含量仅

3、次于纤维素的芳香族多聚少、序列最保守的基因，对木质素的合成起着重要作物，主要沉积于植物的次生细胞壁和维管组织中，在植用。对拟南芥日(CYP98A3)基因的研究表明，当物水分运输、机械支撑、抵抗紫外辐射和抵抗病原菌中C3H基因突变后，refS突变纯合体(refS／ref8)中木质素起着重要的作用⋯。过多的木质素影响饲草的饲用的总量下降而且组成比例发生改变，植物表现极度矮性，使牲畜消化率降低；同时木质素含量过高导致工业小的表型，但ref8突变杂合体植物(REF8／ref8)与野利用时成本增加，并造成环境污染，因此通过降低木质生型并没有明显区别’。白杨中降低C

4、3H基因的表素含量或改变木质素结构逐渐成为基因工程的研究热达后，木质素总量下降到原来的一半，其中G型和s型点之一。植物中主要有10种酶参与到木质素生物木质素下降，但是原本含量很低的H型木质素明显增合成途径中，香豆酸-3-羟化酶(coumarate3一加。苜蓿中对日基因的研究也有类似的结果。hydroxylase，C3H)是该途径关键酶之一。C3H属于因此，C3H基因是利用基因工程手段调控植物木质素细胞色素P450单氧化酶，催化对一香豆酰莽草酸／奎宁含量的一个重要候选基因。酸(p-coumaroylshikimate／quinate)到咖啡酰莽草酸／柠条锦

5、鸡儿(CaraganakorshinskiiKom．)是我国奎宁酸(caffeoylshikimate／quinate)的C3位置的羟基西北地区重要的豆科锦鸡儿属饲用灌木，由于具有很化反应。日基因是木质素合成途径中家族成员最强的抗逆性，因此在生态造林方面有着重要价值。研究表明，柠条锦鸡儿木质化程度影响了它在饲用和工收稿日期：2013-01-22修回日期：2013-02-01国家自然科学基金(31060105)、教育部新世纪优秀人才支持计业上的利用价值。据报道，柠条锦鸡儿木质素含量为划(ECNT．11-1020)、教育部博士学科点基金博导类联合资助项目18

6、．3％In]，但不同的研究者研究结果也不尽相同。本(20111515110001)、内蒙古自然科学基金重点项目(2010Zd13)资研究克隆了柠条锦鸡儿C3H基因并利用拟南芥突变体助项目通讯作者，电子信箱：liguojing@imau．edu．cnret8对其功能进行了初步研究，为研究C3H基因在柠62中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1．33No．42013条锦鸡儿木质化过程中的作用奠定了基础。以柠条锦鸡儿cDNA为模板，以F—C3H和R-C3H为引物(引物5分别加BamHI和SalI酶切位点)，利用高1材料与方法保真酶Prime

7、STAR(TaKaRa公司)进行PCR扩增。扩1．1材料增条件：98℃预变性3min，98cI=变性15s，58cI=退火柠条锦鸡儿种子采自内蒙古赤峰市，播种于装有30s，72℃延伸1min30s，72℃补充延伸10min，30个循蛭石的培养钵中，置于25oC、16h光照／8h黑暗、光照强环。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。以柠条锦鸡度7000—8000lux条件下培养。取一个月苗龄小苗用儿gDNA为模板扩增基因组全长。反应条件同cDNA于实验。拟南芥C3H基因突变体refS由普渡大学Clint扩增，延伸时间改为4min。cDNA和gDNA扩增产物连C

8、happle教授馈赠。入平末端载体pEASY．Blunt．T载体(全式金公司)，