包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立-论文.pdf

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1、·1070·中国生物制品学杂志2014年8月第27卷第8期ChinJBiologicalsAugust2014，Vo1．27No．8·技术方法·包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立吴凯，樊会兰，赵志宏，白梅，陈磊，周燕美，包南艳，郭秋岑，钱红兵，李生迪云南沃森生物技术股份有限公司，云南昆明650106摘要：目的建立检测伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)抗体的间接ELISA方法，并进行验证。方法对常规间接ELISA方法进行优化，确定抗原最适包被质量浓度及被检血清最佳稀释度、最适包被温度及时间、包被抗原与血清的最适温度和时间、血清与酶标二抗及封闭的

2、最适温度和时间、酶标二抗最适工作质量浓度，并验证该方法的灵敏度、精密性、特异性及耐用性；用伤寒vi多糖结合物原液和伤寒vi多糖衍生物经小鼠大腿内侧皮下免疫，分别于免疫后第l4、21、28、35天，经眼眶采全血，分离血清，应用建立的间接ELISA方法检测抗体水平，计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果确定了间接ELISA方法最适工作条件：伤寒vi荚膜多糖抗原最适包被质量浓度为5Ixg／ml，血清最佳稀释倍数为1：40；最适包被温度及时间为4℃12h；包被抗原与血清最适反应温度和时间为37℃2h；血清与酶标二抗最适反应温度和时间为37℃1h；封闭液最适封闭温度和时间为室温1h；HRP标记的羊抗鼠

3、IgG最佳反应浓度为1：8000。该方法灵敏度为1：1600；孔间和板问CV平均值分别为2．8％和5．8％；与其他血清无交叉反应；pH值、包被时间、包被温度及酶结合时间调整前后，同一样品检测的值差异无统计学意义(P>0．05)。伤寒Vi多糖与蛋白载体偶联后，免疫原性明显增强，且白喉类毒素(diphtheriatoxinDT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinantPseudomonasaerug~nosaexotoxinA，rEPA)两种不同载体偶联得到的结合物免疫原性无明显差异。结论成功建立了一种检测伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法，该方法具有较强的特异性、灵敏度及精密性。关

4、键词：伤寒沙门菌；荚膜多糖；间接酶联免疫吸附试验中图分类号：R378．2+3R392—33文献标识码：A文章编号：1004．5503(2014)o8—1070—06DevelopmentofanindirectELISAmethodfordetectionofSalmonellatyphiantibodyinmouseserumusingtyphoidVipolysaccharideascoatingantigenWUKai，FANHuilan，ZHAOZhi．hong，BAIMei，CHENLei，ZHOUYan—mei，BAONan-yan，GUOQiu—oen，QIANHong—bi

5、ng，LISheng—diWalvaxBiotechnologyCo．Ltd，Kunming650106，YunnanProvince，ChinaCorrespondingauthor：L1Sheng-di，E-mail：llssdd0627@sincLcomAbstract：ObjectiveTodevelopanindirectELISAmethodfordetectionofSalmonellatyphiantibody．MethodsTheconditionforroutineindirectELISA，includingantigenconcentrationforcoating

6、，dilutionofserumtobetested，temperaturesandtimesforcoating，forreactionsofcoatingantigenwithserumandserumwithenzyme—labeledsecondaryantibodyandforblocking，aswellasworkingmassconcentrationforenzyme—labeledsecondaryantibody，wereoptimized．Thedevelopedmethodwasverifiedforsensitivity，precision，specificit

7、yanddurability．MicewereimmunizedS．C．withbulkoftyphoidVipolysaceharideconjugateandderivativeoftyphoidVipolysaecharide．Serumsampleswerecollectedfromtenmiceondays14，21，28and35afterimmunizationrespectively，anddetermi