动态细胞因子检测--ELISPOT技术原理及应用 2016.pdf

《动态细胞因子检测--ELISPOT技术原理及应用 2016.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、动态细胞因子检测--ELISPOT技术原理及应用达科为生物工程有限公司研发部周翔2016.4ELISPOT原理•酶联免疫斑点检测：Enzyme-LinkedImmunoSpotAssay,ELISPOT•细胞培养+刺激物•“酶联免疫”：基于酶促反应放大效应的免疫学检测。•“斑点”：沉积在固体基板上的有色斑点。一个斑点对应一个细胞！ELISPOT操作过程动画演示1>包被：将包被抗体/抗原包被到PVDF膜板上;2>细胞孵育;3>靶细胞活化分泌细胞因子/抗体;4>移除靶细胞，加入检测抗体或生物素化抗体捕获分泌细胞因子/抗体;5>加入

2、酶标二抗或酶标亲和素（HRP、ALP）;6>显色，斑点形成;ELISPOT基础假设•大小40-200μm斑点频率斑点核晕结构形成的原理20406080100120140160180200220斑点直径（um）斑点直径（单位：微米）ELISPOT技术优势动态的免疫检测--斑点代表分泌细胞在一段时间内的动态，即“Footprint”（特异性刺激物+群体中特异性细胞）灵敏度高：1个/40万细胞单细胞水平功能性检测实现高通量检测直观，可信度高检测成本低细胞因子分泌细胞抗体分泌细胞(Tcells)(Bcells)ELISPOT简史•19

3、83年,澳大利亚人Czerkinsky和瑞典人Sedgwick受ELISA技术启迪，同时独立发明ELISPOT技术：计数分泌抗体的B细胞个数•1985年，硝酸纤维素膜NC膜，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶。•1988年，Czerkinskyet.al.:首次将应用扩展到细胞因子检测领域，TcellIFN-γ;同年出现双色标记技术；•1993年，首次将PVDF膜板引入ELISPOT•1995年,扫描技术的分析仪ELISPOT图像分析仪发展简史•92年，德国莱卡公司推出了第一台ELISPOT图像分析仪•95年，德国卡尔蔡司，Bi

4、o-Sys公司基于显微技术的分析仪•95年，德国AID和美国CTL公司基于扫描技术的分析仪•数码识别技术的出现•检测多细胞因子•荧光FluoroSpot德国BioSys公司BioReader4000型全自动ELISPOT图像分析处理系统底板材质的改进•琼脂糖•玻璃片•塑料板•硝酸纤维素膜•PVDF（聚偏二氟乙烯）膜•透明塑料板•结构三维化检测内容的多样化•检测B淋巴细胞分泌的抗体•检测细胞因子商业化•荷兰U-CyTech公司•瑞典Mabtech公司•法国Diaclone公司•美国BDPharmingen公司•美国R&D公司•达

5、科为公司•......预包被化预包被的优势板条可拆卸化双色ELISPOTFluoroSpot：双因子FluoroSpot：多因子实验操作指导•关于洗涤的问题•关于显色结果好坏的判断A实验孔B实验孔C实验孔A负对照B负对照C负对照成功失败来源于血液的PBMC•注意空腹采血。•血液要及时做PBMC分离。•使用无毒性的淋巴细胞分离液。细胞状态•存活率=活细胞数/（或细胞数+死细胞数）×100%•杂蛋白的干扰•基因组DNA的干扰•细胞凋亡与细胞计数（容易忽略的关键地方）细胞状态是决定实验成败的关键因素之一来源于脾脏的淋巴细胞•处死小鼠

6、前最好禁食6-8小时。•处死之后立刻做淋巴细胞分离。•使用无毒性的小鼠脾脏淋巴细胞分离液。不同脾细胞处理方法对ELISPOT检测的影响；负对照负对照负对照实验孔实验孔实验孔红细胞裂普通小鼠淋巴达优分离液（新解法细胞分离液分一代介质）离经过冻存、复苏的淋巴细胞•细胞必须达到至少80%的存活率。•达优冻存试剂盒，存活率可以达到90%•有利于标准化非特异性的刺激物•植物凝血素（PHA）•伴刀豆蛋白A（ConA）•离子酶素/佛波酯（Ionomycin/PMA）•细菌脂多糖（LPS）T细胞表位肽•最好的特异性刺激物•可以直接被呈递给T细

7、胞。•T细胞表位肽库CEF（32条多肽混合）•ICE多肽库（23条表位肽）•使用限制很多重叠多肽库•不需要知道T细胞表位肽位置信息和检测对象MCH基因型•人工合成一系列的多肽（通常是15aa），覆盖蛋白序列的每一区间：Aa1-15、Aa2-16、Aa3-17……Aa(n-14)-n。•依赖生物信息学•它不能直接被APC呈递蛋白质•含所有的T细胞表位肽信息，可不考虑MHC的基因型•相对廉价•纯度难以保证不同刺激物条件下：斑点与细胞数目的关系特异性细胞数目与斑点数目的线性范围ELISPOT技术的标准化•细胞类型•细胞状态•细胞计数

8、•刺激物、试剂盒与血清•实验操作流程与斑点显色•斑点计数与数据处理ELISPOT检测的质量控制•控制ELISPOT检测的质量（结果的准确性、重复性、可信度等等）•标准细胞必须采用冻存细胞库•标准刺激物选用CEF或者ICE•实验室内部质控与实验室之间的质控以及国家质控体系小结：