发酵法制备葡聚糖菌种培养.doc

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1、发酵法制备葡聚糖菌种培养右旋糖酹又名葡聚糖，是若干葡萄糖脱水形成的聚合物，它作为血容量补充药已广泛用于医疗临床，不同分子量的右旋糖酊具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等活性。右旋糖酹的制备方法有发酵法和酶法。右旋糖酹的产牛菌株一般为肠膜明串珠菌。代表性菌株是美国NRRL研究所分离的肠膜明串珠菌NRRLB-512F,该菌株已经被工业化应用。国内右旋糖酊的制备多使用肠膜明串珠菌。本文选用购于小国工业微生物菌种保藏屮心的肠膜明串珠菌20074,以培养液浊度和pH值作为考察指标，对培养基进行优化。1实

2、验部分主要仪器与材料UV-4802H双光束紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。肠膜明串珠菌：中国工业微生物菌种保藏中心,cicc编号为20074o基础培养基组成：蔗糖13%、蛋白月东％、磷酸氢二钠％、磷酸二氢钾％。实验方法培养基的配制液体培养基：按照培养基组成称量药品,加水加热煮沸溶解，冷却到室温之后毘容，调节pH到指圧值，将培养基分装到锥形瓶和试管中，塞好棉塞，用牛皮纸包扎，压力下灭菌20min,然后自然冷却。固体培养基：在灭菌之前的液体培养基中加入犷2%的琼脂，煮沸溶解，分装之后，塞好棉塞，用牛皮

3、纸包扎，压力下灭菌20min,然后自然冷却。菌种活化及保存将安错管在75%的酒精屮浸泡30min,在酒精灯上方烘烤然后滴少许无菌水在瓶口，用锡子轻轻从瓶口裂痕处敲开，加入无菌水，摇动至呈乳浊液，用接种环接种于斜面和平板培养基上，在指定温度下恒温活化3d。活化后选择平板或者斜面上面生长较好的菌落，接种于液体培养基小传代培养「2d,即可使用。以上均为无菌操作。菌种保存：活化后液体培养基中培养2飞d的培养液分别接种于斜面上，指定温度下培养48h,4°C冰箱中保存。菌种保存在斜面上，每1个月转接1次。首先由斜面转接到

4、液体培养基中，培养10h,接种到斜面上，培养48h,放入冰箱，4°C保存。基础培养基组分含量优化分别改变培养基中的蔗糖、蛋口月东、Na2HPo4和kH2Po44种基础组分的含量，接种量5%,在28°C、100r/min时恒温摇床培养24h,以起始培养基为空白在X=450nm时测定浊度，同时测定培养液pH值。各个组分含量的变化如表1所示。培养基中无机氮源的选择在培养基中加入不同种类和含量的无机氮源，培养条件同，以起始培养基为空口在入=450nm时测足浊度，同时测足培养液pH值。无机氮源的种类和含量的变化见表2。

5、培养基中添加剂的选择在培养基中加入不同的添加剂，培养条件同，以起始培养基为空白在X=450nm时测定浊度，同吋测定培养液pH值。培养基中金属离子的选择在培养基中加入不同的金属离子，选用L16正交表，做正交实验，培养条件同，以起始培养基为空白在X=450nm时测圧浊度，考察金属离子种类和含量对菌生长的影响。各因素水平见表3。■■■§3生长曲线的测定将斜面保存的菌接种到液体培养基中，培养10h之后得种子培养液。接种5%的种子培养液到新的培养基中，将接种后的液体培养基分装于试管中，每支试管5mLo在28°C、100

6、r/min下恒温摇床培养，每2h取样1支，以起始培养基为空白在入=450nm时测定吸光度，同时测定培养液pH值。2结果与讨论基础培养基组成对菌体生长的影响蔗糖含量对菌体生长的影响蔗糖在右旋糖酹的制备过程中，是碳源也是底物。蔗糖作为碳源在肠膜明串珠菌20074的作用下产生右旋糖酹蔗糖酶，右旋糖酹蔗糖酶将作为底物的蔗糖转化成右旋糖酉干和果糖。蔗糖含量改变对培养液浊度和pH值影响见图1。蔗糖含量为10%时，培养液中菌含量达到最大，pH值下降到最低，说明此条件下中菌体生长较好。蔗糖浓度太低可能是底物浓度不足，太高可能

7、会抑制肠膜明串珠菌20074的生长，所以选择蔗糖含量为10%。蛋白月东含量对菌体牛长的影响蛋白月东由蛋白质水解而制得，在细菌的培养屮为菌体的生长提供主要的氮源，是细菌培养基应加入的营养物质。蛋白月东含量改变对培养液浊度和pH值影响如图2所示。当蛋口月东含量增加到%之后，培养液浊度和pH值随蛋白月东含量的增加变化不大且蛋白月东的增加会增加培养成本。因此，选择培养基蛋口月东含量为％。、kH2Po4含量对菌体生长的影响Na2HPo4为菌的生长提供磷和钠，这2种元素对菌的生长是必需的，同时,Na2HPo4还能对培养液

8、的pH值起到缓冲作用。培养基中Na2HPo4的浓度对培养液浊度和pH值的影响见图3o虽然含量的增加使培养液浊度增加，但当浓度大于％后培养液浊度下降，说明对菌体的生长产生不利的影响，所以选择％。k+也是菌体生长必需的兀素之一，培养基中kH2Po4的浓度对培养液浊度和pH值的影响见图4。在本实验条件范围内，kH2Po4含量为％时，培养液浊度出现最大值，而且pH值增加速度开始变大，所以选择基础培养基中kH