生物化学实验五-酵母核糖核酸的分离及组分鉴定.doc

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1、实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的要求学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、实验原理酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。三、器材与试剂1〉材料酵母粉。2〉器材乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。3

2、〉试剂(1)0.04mol/L氢氧化钠溶液。(2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。(3)95%乙醇。(4)乙醚。(5)1.5mol/L硫酸溶液。(6)浓氨水。(7)0.1mol/L硝酸银溶液。(8)三氧化铁-浓盐酸溶液：将2ml10%三氧化铁溶液(用FeCl3·6H2O配制)加入到400ml浓盐酸中。(9)苔黑酚乙醇溶液：溶解6g苔黑酚于100ml95%乙醇中。(10)定磷试剂。a.17%硫酸溶液：将17ml浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83ml水中。b.2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵

3、溶于100ml水中。c.10%抗坏血酸：将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。四、实验步骤1〉RNA提取将10g酵母悬浮于90ml0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌

4、一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。2〉鉴定取200 mg提取的RNA，加入1.5 mol/L硫酸溶液10 ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。(1)嘌呤碱：取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。(2)核糖：取一支试管加入水解液1mL、三氯

5、化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。(3)磷酸：取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。五、结果处理记录现象并解释。现象：(1)与硝酸银反应生成了少量的银化合物沉淀。(2)反应后沸水浴，溶液变成绿色。(3)反应后沸水浴，溶液变成蓝色。