血清灭活及培养基.doc

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1、人们通常通过在56°C加热30分钟的办法，来灭活血清中的补体，以及其中可能的微生物（比如支原体）的污染。加热灭活带来的问题是，血清中的氨基酸、维生索和生长因子等也会不同程度的被破坏。TrigliaandLinscott的研究发现（1）,胎牛血清中的补体含量很低，即使在未稀释的胎牛血清中，也观察不到溶血现象。另外37。（2的加热能够仃效灭活补体。所以对胎牛血清而言，并不需要通过专门的热灭活来灭活其中的补体。早期的血清制备中的滤膜的孔径大于0.22um,不能彳j效的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是

2、现在血清制备中的终端滤膜的孔径为0.1urn甚至小到0.04um,所以血清中一般没有支原体的污染。综合上而的观点,除非有特别的情况,标准厂家生产的胎牛血清…般不需要加热灭活。需要说明的是，冇些厂家生产的胎牛血淸质量并不符合标准。笔者曾购买过国内一厂家的胎牛血清，没彳j灭活时细胞生长状态明显变差。所以如果您的胎牛血清来自一家可信度不髙的厂家,那么为了安全起见，还是以加热灭活为好。2培养液中一定要加抗生素随着超净台技术的提高，和超净台在细胞培养中的广泛使用，在细胞培养过程中如果操作规范，引进污染的机会并不大。同时抗

3、生素的使用大大增加了支原体等微生物污染的机会，所以普通的细胞培养，最好不要加抗生索。3细胞培养室要异常的洁净山于以前超净台技术比较差，在超净台开启的时候，外面的灰尘可能飘到超净台里，笔者曾经见过的一个老式的没有空气过滤装置超净台,仅使用紫外线灯灭菌,这样实验室的清洁就显得很巫要。现代的超净台从原理上来说，超净台外的污染源是很难到达超净台里面的。所以保持细胞培养室一淀程度的清洁固然冇助于减少污染的机会，但是过度的清洁，比如用（）.2%新洁尔灭拖地板，或者在培养室内加紫外线灯消毒，并不需要，更重要的是实验操作的规范

4、。笔者曾经丁作过的一个细胞培养室，维护实验室清洁的工作就是每天拖一次地板，每天大家进出并不换鞋换衣服，在2年多的时间内从没有发生过任何污染。4在超净台上使用酒精灯爭实上使用酒精灯会造成空气对流，从而带起超净台面上的灰尘，反而增加污染的机会。更何况还增加了火灾的隐患。培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂基础培养基绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液（BSS）基础上，添加了氮基酸、维生素和其它与血

5、清屮浓度相似的营养物质。虻空用的培养基是Eearle'sMEM的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham'sF12也包括非必须氨基酸，维生素的范囤亦很广，另外常规禽有无机盐和代谢添加剂（例如核甘酸MEM/F12这两种培养基各取1/2,形成神经生物学报通用的培养基。Dulbecco's改良培养基一DMEM,现应用于快速工长的细胞，同MEM含冇相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，何知道大多数情形下培养基部有不足。例如，有些培养基在氨基酸屮包括有谷氨酸，而这种培养基虽广

6、泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境屮时。F12屮含仃硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。一„在所有这些培养基屮,谷氮酸比其他氮基酸有更高的浓度,这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养屮它常川作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加匍萄糖的含最到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基屮这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的C02来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3,要用10%的C02来平衡，当然也可以在较低C

7、O2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养屮使用也能有比较令人满意的结果。原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz'sL15培养基可用来在大气环境屮令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基屮使用半乳糖作碳源，以阻止培养基屮乳酸形成，少量溶解的C02市丙酗酸代谢产生。这

8、一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高C02有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究屮。L15培养基C用来成功的培养了外周神经元，但询未在CNS神经元的发冇研究屮全而检测过。血清细胞在单纯的基础培养基屮不能存活，在特殊类型的细胞培养屮必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，