细胞培养流程.doc

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1、细胞培养流程玻璃器皿清洗流程1.生理盐水瓶等清水冲洗、浸泡后除去标签2.清水涮洗3.洗洁精/洗衣粉水浸泡过夜（＞16-18h）4.清水涮洗（＞10次）5.泡酸过夜（＞16-18h）6.清水涮洗（＞10次）后，流水冲洗过夜（＞16-18h）7.涮单蒸水三次8.50-60°C24h烤干后，铝薄纸、牛皮纸封闭瓶口，铺巾包裹9.120°C,lOOkPa高压20inin,50-60°C24h烤干备用（2周内）常用溶液配制DMEM溶液的配制1制备新鲜三蒸水。过滤器装好0.22pm滤膜，用三蒸水湿润，120°C,lOOkP"高压20分钟。2将一包DM

2、EM培养基干粉倒入烧杯，用三蒸水洗包装袋内面2-3次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌（l-2h）使之完全溶解。3根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠（0.02g）；根据实验需要，添HEPES（5・20mmol/L）、谷氨酰胺和其他特殊物质。4加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。5必要时用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH。加水定容至1L。pH7.2・7.4。6负压泵连接过滤器过滤除菌，分装于无菌100ml生理盐水瓶中（90ml/瓶），20°C冻存。配制好的培养液使用时，37°C复温，根据需

3、要加入血清（5%-20%）培养细胞。HEPES(260.3)15mMHEPES3.905gDistilledwater1000ml（或直接加入IL培养基中）常用平衡盐溶液(balancedsaltsolution,BSS)配制方法(g/L)RingerPBSHanksD-HanksDulbeccoCaCl20.25—0」4--一KC10.420.20.40.20.2KH2PO4—0.20.060.20.2MgCl-6H2O0.10一一MgSO4-7H2O——0.10—NaCl9.08.0&0&08.0NaHCO3一―0.35一Na2HP

4、O4-2H2O(269)—1.560.092.162.16NaH2PO4-2H2O一——D-glucose——1.0—一酚红——0.010.02一消化液配制0.25%Trypsin+0.02%EDTA(pH8.0,37°C)Trypsin(1:250)0.25gEDTA0.02gD-hanks(Ca2^/Mg2+free)100ml0.22pn滤膜过滤除菌后分装于高压灭菌过的小青瓶中。・20°C冻存。Cryopreservationsolution(冻存液)DMSO(二甲基亚飒)/甘油(高压灭菌)1ml(10%)胎牛血清培养液2ml(2

5、0%)7ml(70%)原代细胞培养骨僦细胞培养1、高压手术器械及玻璃器皿：小弯剪(2)、小弯银(2)、皮银(1)、过滤网、离心管(4)、吸管(4)、小圆试管(4)、平皿(2)2、方法%1器械盒等放入超净台，紫外灯消毒30分钟%1酒精灯烧试管、离心管等备用，平皿中加入L-DMEM—10%FCS%1处死或过量麻醉实验动物，浸泡于75%酒精5分钟%1小心分离取双侧股骨，勿破坏骨髓腔，放入平皿屮，剥离其他组织%1移入另一平皿，放入超净台，从中间剪断股骨，5ml注射器反复抽吸、吹洗%1经滤网过滤去除组织块，移入离心管%1800-1000^7分离心

6、,3・5分钟,2次%1加培养基缓力吹打混匀细胞后，移至50ml培养瓶，37°C,5%C(b培养%1MSC-般2天后换液，肿瘤细胞24h后换液细胞传代细胞长满80%瓶壁后，消化传代1、吸除原培养瓶中的培养液，用无血清培养基洗一次。2、瓶内加入0.25%trypsin+0.02%EDTA消化液(原代因细胞成分较杂，加EDTA较容易消化下来，传代后的细胞一般只用trypsin消化即可)，平摇培养瓶，使消化液流过细胞表面，37°C3-5分钟，显微镜下观察，发现细胞回缩，细胞间隙增大后，即可吸出消化液，移至离心管,加血清终止消化。3、加了EDTA

7、消化的细胞800r离心两次，3・5分/次，吸除上清。如果只是用Trypsin消化的细胞只需离心一次。4、加入L-DMEM—10%FCS1ml重悬细胞，1:2-3分瓶培养°细胞冻存（缓存）1、0.25%trypsin（或+0.02%EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。3、800i•离心5分钟，2次（无EDTA,离心一次即可）4、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:75、50ml培养瓶的细胞（约5X105）,用lml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。6、冻存步骤：4°Clh20°Clh80°Clh196°C

8、液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4°C放置时间40min以上，3h以内，一20°C对细胞损伤最大，lh左右为宜。）细胞复苏（速溶）冻存管直接投入37°C水浴,平摇直至融化，种于50nil培养瓶中。根据细胞贴