细胞培养流程

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1、胶质瘤细胞的体外培养1实验材料1.1细胞株胶质瘤细胞U251MG,U87MG（购自上海细胞库，本室保存）。1.2主要试剂DMEM培养液GIBCO公司胎牛血清Hyclone公司硫酸链霉素大连美罗药业有限公司青霉素山东鲁抗制药有限公司PBS磷酸盐缓冲液福州迈新生物技术有限公司胰蛋白酶Sigma公司EDTASigma公司DMSOSigma公司L-谷氨酰胺Sigma公司NaHCO3北京化学试剂公司其余试剂均为国产分析纯。1.3主要仪器超净工作台（SW-CJ-IF）苏州安泰空气技术有限公司CO2培养箱（spx-300B-

2、Ⅱ）上海跃进医疗器械厂全自动荧光倒置显微镜Olympus公司台式高速冷冻离心机（3K15）Sigma公司小型台式离心机（I-14）Sigma公司DKB-501A型超级恒温水槽上海精密实验设备有限公司精密电子天平（JJ200）常熟双杰测试仪器厂液氮罐成都金凤公司血细胞计数板江苏海门市天龙实验器材厂2实验方法2.1常用设备的消毒2.1.1玻璃器皿的消毒⑴浸泡：将玻璃器皿浸入含有去污剂的水中，让水完全进入瓶皿，不要产生气泡，浸泡过夜。⑵刷洗：用软毛刷轻轻刷洗，不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。自来水冲干净后晾干

3、。⑶泡酸：器皿在酸缸中浸泡过夜，浸泡时让器皿充满酸液，勿留气泡。⑷冲洗：将器皿从酸缸中捞出，用自来水冲洗10次，流水冲洗过夜，晾干。蒸馏水漂洗3次，烤箱内烤干。⑸消毒：用锡箔纸包装甁皿，高压蒸汽消毒30min，烤箱内烤干。2.1.2金属器械的消毒先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包好，高压蒸汽消毒30min，烘干备用。2.1.3橡胶的消毒胶塞先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，晾干后装入铝盒内高压消毒30min，烘

4、干备用。胶头用75％酒精浸泡5分钟，紫外照射后使用即可。2.2细胞培养2.2.1实验前准备⑴75％酒精棉球擦拭超净工作台，将装有玻璃器皿和器械的铝盒、胶头、酒精灯用酒精消毒后在超净台内合理摆放，紫外线照射30min。⑵从培养箱内取出细胞，注意旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。⑶水浴锅预热至37℃，培养液、PBS液和胰蛋白酶置入水浴锅内复温。⑷取出完全复温的培养液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。⑸点燃酒精灯，火焰不能太小。2.2.2细胞复苏⑴从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速将其置37℃水

5、浴，不断摇动，使其快速解冻。⑵待细胞冻存管内液体完全溶解，将细胞冻存管用75%酒精棉球擦拭，置超净台内。⑶将细胞冻存管液体移入15ml离心管，加5mlDMEM培养液（含10%FBS），混匀，1000rpm，离心5min。⑷弃上清液，加2ml培养液混匀细胞后，移入25mm2培养瓶，再添加适量培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。2.2.3细胞传代⑴小心吸除培养瓶内旧培养液，PBS清洗2次。加入适量的含0.25%胰酶消化液，以能覆盖细胞为宜。⑵消化2～5min后，显微镜下观察细胞，发现细胞质回缩、细胞

6、间隙变大、连接松散时，立即加入含血清的DMEM液终止消化。⑶用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有瓶底都被吹到，吹打时轻柔，尽可能不要出现泡沫，制备成单细胞悬液。⑷将细胞悬液吸至15ml离心管中，1000rpm离心3min。去除上清液，加入4～5ml培养液充分混匀，制成单细胞悬液。⑸倒置显微镜下计数细胞，传代细胞的密度不应低于5×105/ml。细胞计数流程：①将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室加盖专用的盖玻片。②用移液器吸取细胞悬液20ml沿盖玻片边缘缓缓滴入，

7、不要溢出盖玻片，也不要让悬液流入旁边槽中，不能产生气泡。③显微镜下，统计计数板四个大格的细胞数（对于压线的细胞只计算在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数）④计算细胞密度（细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4）×104×稀释倍数/ml）,对每个样品计数三次，取其平均值。⑹分装细胞悬液至两个或以上的培养瓶中，再加入适量培养液（以覆盖瓶底为宜）。瓶子做好标记。⑺用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件培养箱中培养。2.2.4细胞冻存⑴0.25%胰酶消化处于对数生长期的单层贴

8、壁细胞，将消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。⑵弃去上清液，加入适量预冷的冻存液（血清9份+DMSO1份，混匀后置于4℃冰箱），调整冻存液中的细胞密度为5×106～1×107/ml。⑶用吸管轻轻吹打让细胞重悬，分装细胞悬液(1ml/管),旋紧冻存管管口，封口膜封严。冻存管上做好标记，写明细胞的名称、传代次数、冻存时间等信息。⑷细胞以下条件逐步冻存：4℃30min→-80℃过夜→液氮