细胞培养工作流程

《细胞培养工作流程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙血、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始主产操作。1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查木次操作所用溶液/试剂瓶内是否有显物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外

2、表血后拿入层流罩。复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大得素、7.5%NaHCO3溶液。1.5复苏用水准备：(1)融化种了用溶液：按1L/1支种子准备39±rc含0.1%新洁尔灭溶液。(2)百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1OC含0.1%新洁尔灭溶液。1・6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方nJ操作。1.7溶液使用前处理：辅助人员川止血钳夹酒精棉球点燃后消:毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒粕棉球消毒瓶口及瓶塞。2、配

3、液配方复苏液MEM生长液名称加入量(ml)含最控制范围加入量(ml)含量控制范围MEM培养基溶液100/300/新生牛血清109%〜10%154.5%〜5.5%3%谷氨酰胺溶液10.9%—1%30.9%—1%庆大霉素0.10.12%〜0.13%0.40.12%〜0.13%7.5%NaHCO31.51.5%—1.8%4.51.5%〜2%辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新住牛血清等溶液至MEM液小，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔

4、注明用量、日期等。复苏液及纶长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。辅助人员打开混匀后的复苏液，放直盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入英中（加屋：0.3〜0.4ml/cm2）,拧紧瓶盖并放在恒温家待用。3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据牛产指令按数量支领。木操作规格按复苏1支细胞种了到1个T75cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出

5、细胞种子时，在液氮罐颈部停留儿秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种了屮领单上的内容是否一致。核对无谋示，迅速全部浸入39±1OC含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml/支种了），顺时针不停摇动肯至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1OC含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用lml的吸管将融化后细胞种了吸出，缓慢滴加到1个T7

6、5cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏H期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。7、清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。8、复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。9、换液换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。用消戟剂擦拭表而后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分

7、钟方对操作。辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶而流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或肓接倒入其中（加ffl：0.3〜0.4ml/cm2）o拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场细胞传代流程1、准备1.1T作地点检查：检杳台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。1.2设施检查：确认空调

8、、蠕动泵工作状态完好。1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台血、墙面、地血、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。1.4操作工具和试剂检杏：检查木次操作所川灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查木次操作所川溶液/试剂瓶内是否有界物，瓶表血是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。细胞