基于间接竞争原理的流式微球技术快速检测麦芽中赭曲霉毒素A.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2016年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry625～632DOI：10．11895／]．issn．0253-3820．151007基于间接竞争原理的流式微球技术快速检测麦芽中赭曲霉毒素A肖昌彬，刘秋桃，豆小文杨美华孔维军万丽“。(成都中医药大学药学院，成都611137)(中国医学科学院北京协和医科大学，药用植物研究所，北京100193)(辽宁医学院药学院，锦州121001)摘要建立了一种快速、灵敏检测中药麦芽中赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)含量的间接竞争流式微球方法。麦芽样

2、品经60％甲醇／PBS提取，加入20％甲醇／PBS溶液稀释5倍后，离心取上清液制备样品。在编码荧光微球上偶联牛血清白蛋白．OTA(BSA—OTA)复合物，与样品中OTA竞争结合抗OTA特异性抗体，然后加入FITC．I孵育，离心洗涤后，用流式细胞仪检测微球表面的平均荧光强度，实现样品中OTA的准确定性定量测定。本方法检测OTA的半数抑制浓度Ic卯为1．20ng／mL，相关系数R=0．9892，检出限(IC。)为0．12ng／mL，加样回收率为93．9％～97．4％，RSD<3．6％。16份实际麦芽样品中检测到2个阳性样品，OTA的最高含量为3．83~g／kg，未超出欧盟的OTA限量标准

3、，与液相色谱-串联质谱(LC-MS／MS)法检测结果相一致。本方法简单、快速、灵敏、可靠，可拓展用于其它复杂基质中多种真菌毒素的定性与定量检测。关键词流式微球技术；间接竞争；麦芽；赭曲霉毒素A；快速检测1引言赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是由曲霉属和青霉属真菌产生的有毒次生代谢产物⋯，具有严重的致癌、致畸、致突变及肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等毒性作用J，已被国际癌症研究机构列为人类可能的致癌物(2B级)，也被美国国家毒理学计划定为极有可能对人类产生致癌性的物质。OTA是食品、农产品及农作物、药用植物中主要的外源性有害污染物，不仅会影响相关产品的质量，而且对人类健康

4、和生命安全存在潜在的威胁_5J。世界各国已对其制定了严格的限量标准，如欧盟联合委员会规定谷物中OTA的限量为5．0kg，谷物制品及其相关产品中OTA的限量为3．0g／kg，酒和葡萄汁饮料中OTA的限量为2．0g／J。因此，开发简单、快速、准确、灵敏且特异性的检测方法，对于保证食品、农产品及药用植物的安全使用以及保证人类健康至关重要J。OTA的检测大多采用仪器分析技术，如液相色谱．荧光法(HPLC—FLD)及串联质谱法(LC-MS／MS)等。虽然这些分析方法具有灵敏、准确的特点，但需大型的昂贵的仪器，操作步骤繁琐、耗时；此外，食品、农产品、中药材等基质成分复杂，需要严格的前处理和净化步

5、骤，给实际操作带来诸多困难。酶联免疫吸附技术(ELISA)以其高特异性、高选择性、对样品纯度要求不高及样品处理量大的优点，而被用于复杂基质中OTA的快速筛查检测_1，J，但存在灵敏度低、重复性差等不足。流式微球技术(Cytometricbeadarray，CBA)驯以一系列荧光强度不同的编码微球为载体，通过激光束激发荧光编码微球，利用流式细胞仪分析微球本身和表面荧光强度完成数据收集和分析，可实现复杂基质中目标物灵敏、准确的快速检测，且重复性和稳定性好、分析时间短、假阳率低。该技术已被应用到多种基质中大分子及小分子化合物的高通量检测卜。OTA为小分子化合物，具有半抗原性、分子量小、单一

6、抗原表位、本身不具免疫原性等特点J，多采用基于“抗体．抗原”特异性识别的竞争型流式微球免疫分析技术，而间接竞争模式因其偶联过程中不损伤，且不阻碍抗体与抗原的识别位点等优势被广泛应用[27,28]。2015-12-23收稿；2016-03-07接受本文系国家自然科学基金(Nos．81473346，81274072)和协和新星人才支持计划资助+E—mail：kongwj302@126．corn；wanli8801@163．corn626分析化学第44卷麦芽为中医临床常用的中药材，具有行气消食、健脾开胃、退乳消肿_2等功效。现代药理研究表明，麦芽还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抑制胆固醇与血脂

7、增加、预防心血管疾病、增强免疫能力等作用。麦芽还是粮食、饲料和酿酒的重要原料。麦芽的制备加工过程中_3，极易霉变变质产生真菌毒素如OTA等。所以，有必要建立适合麦芽中OTA的现场、灵敏、高效的检测方法。本研究建立了一种基于间接竞争模式的流式微球方法，在荧光微球表面偶联牛血清白蛋白(BSA)一OTA复合物，与样品中OTA共同竞争特异性抗体，加入荧光标记的二抗探针后，通过流式细胞仪检测微球本体和表面荧光，实现OTA的定性定量测定。本方法操作简单、检测通量大、检