G-四链体模拟酶结构转化的高灵敏无标记荧光检测DNA.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2015年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1402—1407DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150328基于发卡探针DNA／G．四链体模拟酶结构转化的高灵敏无标记荧光检测DNA宋璐娜张永花薄红艳高强(陕西师范大学化学化工学院，西安710062)(洛阳师范学院化学化工学院，洛阳471022)摘要建立了基于目标DNA诱导的发卡探针DNA转化为G．四链体DNA过氧化物模拟酶的非标记荧光增强型DNA检

2、测新体系。发卡探针DNA即分子信标探针由两部分构成，环状部分与目标DNA互补，茎部一端由一条富G序列构成。无目标DNA存在时，分子信标处于闭合状态，形成发卡结构：富G序列由于部分处于杂交状态，无法形成G四链体。当目标DNA与发卡探针DNA杂交并打开发卡结构，富G序列解链并自发折叠成G-四链体结构。G一四链体结构与血红素结合形成DNA模拟酶，催化H：O还原的同时将无荧光的底物1O-乙酰基．3，7一二羟基吩恶嗪(ADHP)氧化成荧光产物。通过测量荧光信号，实现对目标DNA的定量检测。优化后的体系检测条件为pH8．0，10

3、mmol／LK，0．2~mol／LHemin，50b~mol／LADHP。在优化的条件下，目标DNA在0．005—1．0nmol／L浓度范围内与体系荧光信号呈线性关系，检出限为3．0pmoL／L。本方法可以区分完全互补和单碱基错配的目标DNA。关键词荧光；DNA；发卡探针；G．四链体模拟酶；结构转化1引言近年来，DNA检测在临床诊断、基因变异识别、环境监测、食品安全以及生物学研究等领域的应用愈加广泛，显示出良好的应用前景，引起了研究者的广泛关注⋯。常见的DNA检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)法_2]、质谱法[、光

4、谱法l4]、色谱法5]、电化学法_6]等。在光谱分析中，荧光法具有操作简单、检测快速、灵敏度高和选择好等优点，是DNA定量检测时应用最广泛的方法之一j。分子信标(Molecularbeacon，MB)是一种常用的特异性检测目标DNA或RNA的DNA探针_8J。常规的MB茎环结构的两端通常需要标记荧光基团和淬灭基团．在无目标物存在时闭合形成发卡式的茎环结构，淬灭基团通过荧光共振能量转移的方式淬灭发光基团发出的荧光。当目标DNA与MB的环状区特异杂交之后，闭合的茎环发卡结构被打开，发光基团因远离淬灭基团而发出荧光，根据荧

5、光信号的强度来定量目标DNA。得益于发卡状茎环结构，基于MB的DNA检测方法通常具有较高的选择性和灵敏度，但标记过程较为复杂耗时。此外，目标DNA和MB荧光标记分子的1：1的比例关系也严重制约了基于MB方法灵敏度的提高]。因此，开发高灵敏度的免标记MB逐渐引起研究者的关注[1。近年来，DNA过氧化物模拟酶(DNAzyme)因其表现出过氧化物酶的活性，且具有稳定性好、成本低、易合成、易修饰等优点而成为传感器信号放大研究的热点[11。DNAzyme是富含G碱基的单链寡核苷酸在一定条件下折叠成G．四链体结构，再与血红素结合

6、形成的复合物。利用DNAzyme的催化活性．可以实现多种物质的高灵敏度检测，如金属离子_】、小分子_】、蛋白质_1]和DNA[17]等。在大部分过氧化物模拟酶催化体系中，主要采用2，2一联氮基双(3．乙基苯并噻唑啉一6．磺酸)二铵盐(ABTS)做为酶底物，通过比色法定量[1。虽然比色分析法简单，但检测实际样品时干扰较多且灵敏度较荧光法低因而开发基于DNAzyme催化活性的荧光检测体系逐渐引起了研究者的兴趣。本研究设计了免标记的发卡式荧光DNA分子探针，当探针与目标DNA特异性杂交后，发卡结构被打开．探针DNA的一部分

7、会自发形成G．四链体，在血红素存在时表现出过氧化物酶的活性。以无荧光的1O．乙酰基一3，7一二羟基吩恶嗪(ADHP)为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏2015-04-23收稿：2015-06—17接受本文系国家自然科学基金(No．21175089)、陕西省重大基础研究计划(Nos．2013SZS08一z01，2013szs08一P01)和中央高校科研业务费(Nos．GK21405003，GK261001080)项目资助{E—mail：gaoqiang@snnu．edu．cn第9期宋璐娜等：基于发卡

8、探针DNA／G一四链体模拟酶结构转化的高灵敏无标记荧光检测DNA的DNA检测。2实验部分2．1仪器与试剂uv．2400PC紫外可见分光光度计(日本岛津工公司)；F-7000荧光仪(日本日立公司)；MIR系列PCR仪(东胜创新公司)。ADHP、30％H，O，、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、TritonX一100(Sigma-Aldrich公司)；