银染步骤及注意事项.docx

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1、银染步骤是1固定10冰乙酸min。2清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。3染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。现配染色30min。4清洗迅速洗凝胶次。5显影30g碳酸钠1.5mL37甲醛200uL10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括1用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。2用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。3在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。4甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。5在使用前及时配染色液。

2、银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1ng/蛋白质点故广泛的用在2D凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积

3、在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o100ml乙醇40乙醇o25ml冰醋酸10冰醋酸o加水到250ml致敏30mino75ml乙醇30乙醇o17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠o0.5g硫代硫酸钠o加水到终体积250ml水洗3x10min银染20mino0.625gAgNO3o100ul37甲醛在使用前加入o加水到终体积250ml水洗2x1min注

4、意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o6.25gNa2CO3o50ul37甲醛在使用前加入o加水到终体积250ml终止10mino3.65gEDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸o加水到终体积250ml保存1冰醋酸4℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3最好多配制一份显色液第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液显色到点清晰。4显色过程很快要注意把握时间避免染色过度。5银染液和显色液需要预冷。6所用器皿要很洁净不用手直接接触以免杂蛋白污染7清洗用水尽量用高纯度去离子水蒸馏水更佳可以减少背景着色。