抗体的制备ppt课件.ppt

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1、抗体的制备1一、一些基本概念1.克隆(clone)是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团2抗原(antigen，Ag)2.抗原决定簇是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope)，抗原结合位点Ag123433.单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。4.多克隆抗体(PolyclonalAntibo

2、dy，pAb)用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。4Ag单克隆抗体B1B2B3B4B3B3B3B32多克隆抗体3415单克隆抗体的特点抗体的性质相同，容易纯化、标记。特异性强，具有抗原结合位点的专一性。(不是抗原的专一性！)因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。6但单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有完全相同的表位(100%的交叉反应)，或有相似的表位(不同

3、程度的交叉反应)。7多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。8比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。抗体的纯化、标记比单抗难因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时，血清中含有的杂蛋白比较多。9购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验，使用浓度多少WB（Westernblotting，免疫印迹)IHC(Im

4、munohistochemistry,免疫组织化学)ICC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫电镜)FCM(FlowCytometry,流式细胞仪)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析)10抗体的制备技术经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗

5、原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。11抗体制备技术一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的纯化（四）免疫血清的鉴定（五）免疫血清的保存二、单克隆抗体制备（一）单克隆抗体制备原理12（二）单克隆抗体制备的技术要点（三）影响杂交瘤技术的因素（四）单克隆抗体的应用三、基因工程抗体技术（一）人源化抗体（二）小分子抗体（三）双特异性

6、抗体（四）抗体库技术抗体制备技术13二、多克隆抗体制备(一)免疫原的制备免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原141.颗粒性抗原的制备(1)红细胞抗原的制备：A、新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配制成2~5%，直接进行注射免疫。B、新鲜血+抗凝剂—4℃保存4W，免疫前取适量抗凝绵羊血，按A处理。C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。15(2)细菌抗原的

7、制备：取标准菌株，接种。H抗原：取有动力的菌株液，用0.3~0.5%甲醛处理。O抗原：菌液于100℃2.5h。Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。16(4)组织细胞粗抗原：所用的组织必须是新鲜或处理后低温(-40℃)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物，在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)/消化。17粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法：注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒~1min)进行

8、，时间过长会导致产热，破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。匀浆液经离心，沉淀中含大量的组织细胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。182.可溶性抗原的制备可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。(1)细胞破碎：有如下方法：A、反复冻融法：置-15~-20℃冻结，然