《抗体制备过程》PPT课件.ppt

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1、单克隆抗体制备过程临床兽医系:吴黎明学号：08302110124单抗技术的基本原理小鼠骨髓瘤细胞能在动物体外无限繁殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖，又能产生特异性抗体，可通过有限稀释法经筛选培育成由单个细胞增殖而成的克隆株。该克隆株如不发生变异，就可大批量的生产高特异性和高纯度的单抗。单克隆抗体的优越性1.目的性明确人们可以在动物体内或体外按自己的需要生产不同类型的单抗。任何抗原、半抗原，包括各种细菌、病毒、激素、酶类、氨基酸序列、核酸，还有其它异体蛋白或糖蛋白

2、等均可以用来免疫动物，利用杂交瘤技术获得相应的单抗。2.特异性高单抗是针对某一种特定抗原或抗原上特定决定簇制备的，与其它抗原无交叉反应性。与其它常规免疫血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一，便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫苗、生产生物制剂和用于基础研究的重要手段。3.生产简单，易于标准化一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定合格后可置液氮中长期保存。如不发生变异，染色体不丢失，就可长久源源不断的大批生产高特异性和高纯度的单抗单克隆抗体制备示意图

3、一、细胞融合前准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml0.2ml／点)↓3周后第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或

4、ip)│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv(静脉内注射)↓3天后取脾融合(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射

5、器注入6～8ml培养液↓反复冲洗，吸出冲洗液↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟↓用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml↓加入96孔板，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。(三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系

6、，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感

7、性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。(四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针

8、芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一)细胞融合流程(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在