trizol法提取蛋白质.doc

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1、Trizol法提取RNA+蛋白1.取冻存组织加入1mlTrizol（invitrogen）匀浆，样品量不可超过总体积的10%，室温孵育5min，超声粉碎至组织完全溶于液体中；2.加入0.2ml氯仿，剧烈晃动15s，室温孵育2-3min，4℃12000×g离心15min；此时溶液分为水相和有机相。3.小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，用于提取RNA，进行PCR实验）；4.在剩下的中间层及有机相中加入0.3ml无水乙醇，颠倒充分混匀后室温放置2-3min，4℃下2000×g离心5min；5.小心吸取并收集上层有机相（沉淀为DNA），转移到新的离心管中，加入1.5m

2、l异丙醇，轻轻混匀后室温放置10min，4℃下12000×g离心10min；此时沉淀为蛋白。6.弃上清液，加2ml0.3M盐酸胍（95%乙醇溶解）清洗沉淀3次，每次清洗过程中，先将沉淀保存于清洗液中20min，然后在4℃下7500×g离心5min。最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15s后在室温下放置20min，然后在4℃下7500×g离心5min。7.丢弃上层液相，将沉淀真空干燥5-10min。然后将沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸钠）中。在50℃水浴中反复吹打以助溶。不溶物在4℃下10000×g离心10min去除。收集上清，转移到新的收集

3、管中。该上清中的蛋白样品可直接用于Western Blotting实验或保存于-20℃。 常见问题：1.得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底；最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解2.蛋白质降解：组织取出后未马上冷冻3.电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分