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时间:2020-03-10
《trizol法提取蛋白质.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Trizol法提取RNA+蛋白1.取冻存组织加入1mlTrizol(invitrogen)匀浆,样品量不可超过总体积的10%,室温孵育5min,超声粉碎至组织完全溶于液体中;2.加入0.2ml氯仿,剧烈晃动15s,室温孵育2-3min,4℃12000×g离心15min;此时溶液分为水相和有机相。3.小心吸取并丢弃上层水相(该水相中富含细胞总RNA,用于提取RNA,进行PCR实验);4.在剩下的中间层及有机相中加入0.3ml无水乙醇,颠倒充分混匀后室温放置2-3min,4℃下2000×g离心5min;5.小心吸取并收集上层有机相(沉淀为DNA),转移到新的离心管中,加入1.5m
2、l异丙醇,轻轻混匀后室温放置10min,4℃下12000×g离心10min;此时沉淀为蛋白。6.弃上清液,加2ml0.3M盐酸胍(95%乙醇溶解)清洗沉淀3次,每次清洗过程中,先将沉淀保存于清洗液中20min,然后在4℃下7500×g离心5min。最后一次清洗后,丢弃上层液相,将沉淀悬浮于2ml乙醇中,涡旋震荡15s后在室温下放置20min,然后在4℃下7500×g离心5min。7.丢弃上层液相,将沉淀真空干燥5-10min。然后将沉淀溶解于1% SDS(十二烷基硫酸钠)中。在50℃水浴中反复吹打以助溶。不溶物在4℃下10000×g离心10min去除。收集上清,转移到新的收集
3、管中。该上清中的蛋白样品可直接用于Western Blotting实验或保存于-20℃。 常见问题:1.得率低:样品裂解或匀浆处理不彻底;最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解2.蛋白质降解:组织取出后未马上冷冻3.电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充分
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