trizol法提取RNA

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1、植物总RNA的提取抽提RNA所用的研钵酒精灼烧5-10min.，其他器皿均用0.1%的DEPC水处理，24hr.后高温高压灭菌两次，以去除RNA酶，所有试剂都保证没有RNA酶污染。1)1.5ml离心管中加入1mlTrizol，取0.1g组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混匀。2)将混匀的组织在15-30℃放10min，使核酸蛋白复合体物完全分离。3)4℃，10000rpm离心20min，取上清。4)加氯仿200μl，5MNaCl200μl，剧烈振荡15s，室温放置3min（或

2、不放置，直接离心）。5)4℃，10000rpm离心20min，样品会分成3层，取上层水相，取上清。176)加500μl异丙醇，混匀，室温放置10min。7)4℃，10000rpm离心15min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。8)加1ml75%乙醇，洗涤沉淀，重复两次，洗涤用4℃，7500rpm离心5min，弃上清。9)吹干约15min。10)加50μlDEPC处理的水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。DNaseI处理消化植物总RNA中的基因组DNA1)取5μl的植物总RNA，然后顺序加

3、入1μl10×缓冲液，1μlDNase，3μlRNase-free水，总体积10μl，充分混匀后，37℃温育30min。2)加入1μl终止缓冲液，65℃温育10min，使DNase失活。反转录cDNA1)在上述总体积为11μl反应液中加入1μlOligo(dT)18引物4μl5×缓冲液，2μldNTP，1μl反转录酶，1μlRNase抑制剂，总体积20μl，充分混匀后，42℃温育1-1.5hr。2)70℃温育10min，终止反应trizol法提取RNA步骤2010年03月09日星期二17:07从

4、组织中提取总RNA1)液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转移入离心管进行第2步操作。2)匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。从细胞中提取总RNA1)培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/m

5、l比例加入。2)悬浮细胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。2．细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。3．12000rpm离心5min，弃沉淀。4．按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。5．4℃12000g离心15min。6．吸取上层水相，至另一离心管中。注：1）千万不要吸取中间界面。2)若同时提取D

6、NA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。7．按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。8．4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。9．按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。10．4℃8000g离心5min，尽量弃上清。11．室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。12．可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-

7、60℃5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。12、测O.D值定量DNA浓度。注：1）此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之间。2)产率估计：组织标本：（ugRNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量。2、组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染。3、高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃1200离心10m

8、in去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉。4、热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源。5、组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪将组织绞碎，然后再充分研磨。植物总RNA提取-Trizol法　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+