毕赤酵母发酵.ppt

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题目Regulationofalcoholoxidase1(AOX1)promoterandperoxisombiogenesisindifferentfermentationprocessesinPichiapastoris毕赤酵母不同发酵进程中乙醇氧化酶启动子和过氧物酶体生物合成的调控规律文章来源：Journalofbiotechnology 1背景介绍2实验材料和方法3实验结果4结论与分析 1.2过氧物酶体(Peroxisome)：遍布于真核生物的细胞器中,用来去除有害物质.它们用外表的单层膜与细胞的原生质分隔开来,膜上有功能重要的膜蛋白,用以向细胞器中输入蛋白质和促进细胞分裂.与溶酶体不同的是,过氧物酶体不是由分泌通路产生,而是通过先涨大后分裂的自我复制过程产生,当然也有证据显示新的过氧物酶体可以直接产生.过氧物酶体是由比利时细胞学家德迪夫(ChristiandeDuve)在1965年发现的.1.1醇氧化酶AOX1基因启动子作为甲醇诱导的强启动子,在Pichiapastoris表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用。P.pastoris中的转录因子通过特异的顺式作用元件与启动子相互作用而影响基因的转录,因此通过调节AOX1基因启动子的活性可以控制下游基因的表达背景介绍 1.3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因成功地用于描述不同时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征1.4泛素蛋白（细胞液中的短周期荧光蛋白）泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解 二：实验材料和方法2.1：质粒的构建表达GFP-SKlpGLY11245或pGLY13173转化YGLY27355或YGLY31884YGLY14836生产单克隆IgG1抗体表达Ub-R-GFPpGLY10148转化YGLY19309或YGLY29325生产单克隆IgG1抗体2.2：转化：毕赤酵母感受态的制备和电转化的方法（参见nvitrogen公司的Pichia酵母表达手册） 2.3：补料分批培养条件研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（YGLY29325）和过氧化物酶体生物合成（YGLY31884）的调控。诱导阶段分批补料条件ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063/h的基础上以幂指的形式增加SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。DO级联被打开，关闭和搅拌速度被减小到实现氧气的限制 2.4GFP表达的定量和可视化：约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mountingsolution重悬制作切片用Axioscope2Plus显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度 2.5抗体效价的测定在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲和柱与HPLC系统 2.6:细胞裂解从毕赤酵母细胞释放细胞外的DNA使用Quant-iT™PicoGreen®dsDNAAssayKit双链DNA检测试剂盒检测 3实验结果与讨论通过荧光显微术UB-R-GFP和GFP-SKL被正确地定位于细胞质和过氧化物酶体，符合预期3.1: 3.2:YGLY29325的三种不同的补料分批发酵条件的取样数据(a)甲醇限制(ML);(b)葡萄糖培养8h甲醇培养(20h)(SML);(c)氧气限制并额外增加1%甲醇（OL）DO(%)：黑色直线，甘油或葡萄糖：蓝色,甲醇:红色。细胞湿重：黑色三角 3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制-甲醇-限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。（a）GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时;T4中，36±2小时;T5，62±2小时;T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4和T6葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶段 3.4：ML，OL，及（b）SML-过氧化物酶体的生物合成三种不同的培养条件下比较。SML：切换葡萄糖和甲醇进料。在过氧化物酶体中使用GFP-SKL（YGLY31884）进行定量测定。数据点表示在两个独立的运行平均值。星号（*）表示甲醇阶段 3.5三种不同的工艺条件下（YGLY29325）发酵特性-ML，OL和SML。（一）细胞的密度分布（gWCW/L）;（二）细胞列解指数（毫克DNA/L）;（三）抗体效价（毫克/升）;（d）OL条件下延长诱导时间的细胞密度和抗体效价。 3.6在甲醇补料阶段的代谢过程（a）甲醇限定（ML）（b）氧受限（OL）条件下补料分批巴斯德毕赤酵母的培养。 4结论与分析在这项研究中，我们调查AOX1启动子和过氧化物酶体如何被调节以响应碳源（例如甲醇）和氧气分子的可用性在蛋白质生产阶段，以更好地了解在毕赤酵母发酵常用的工艺条件。 AOX1启动子是在ML最活跃下，但OL下不太活跃。过氧化物酶体的生物合成显示对甲醇的消耗高度依赖。在碳限制补料流加过程中过氧化物酶体增殖在含葡萄糖的培养基中被抑制尽管在特定的时间（86H）AOX1启动子诱导的单克隆抗体的生产力在ML的比OL高（0.026比0.020毫克）。但是氧限制条件是一个比较好的流程适用于较长的诱导（180小时）最大量的生产重组蛋白高度依赖甲醇消耗速率 OL培养条件在抗体生产的过程中细菌裂解最小并且能在较长诱导时间（180h）下保持稳定ML在较短的诱导时间（<100h)时具有较高的产能，此外甲醇的消耗速率决定重组蛋白的表达水平。根据我们感兴趣的蛋白或菌株我们已经发展了一系列的工艺条件来优化重组蛋白的生产在一般情况下，最优化的过程集中在工艺参数，而不是AOX1启动子的蛋白在生产过程中调节的理解，然而，这种绿色荧光蛋白的应用程序提供了一个有用的工具来识别低效的流程，让我们可以微调工艺条件和最大限度地提高蛋白生产的生产率。