免疫沉淀试验.ppt

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1、第六章免疫沉淀试验教学目的掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原理熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、沉淀反应的应用一、基本原理免疫沉淀反应（immunoprecipitationreaction）指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。第一节免疫沉淀试验的基本原理形成肉眼可见的大的免疫复合物。第一阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可见环状沉淀试验絮状沉淀试验免疫浊度测定免疫扩散试验免疫电泳技术液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验二、免疫沉淀试验的分类1

2、.阶段性2.特异性3.抗原性质：可溶性4.抗体的选择：2价三、免疫沉淀试验的特点第二节液体免疫沉淀试验一、絮状免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。第二节液体免疫沉淀试验抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例一、絮状免疫沉淀试验1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇絮

3、状沉示意图淀AgAbAg最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—原理：当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在增浊剂中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。二、免疫浊度测定优点：稳定性好、简便快速，易于自动化敏感度高精确度高无放射性核素污染1.根

4、据反应的时间和反应结合的动力学分为速率比浊法终点比浊法2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为透射免疫比浊法散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法分类：透射比浊试验和散射比浊试验光路检测器A检测器BICI0IθIθ透射比浊试验散射比浊试验当复合物＜3×106dal，I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量（2）抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力强，并使用R型抗体（3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5（4）增浊剂补充：免疫浊度测定影响因素（1

5、）抗原抗体的比例在抗体过量的反应体系中,抗原量的递增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个抛物曲线。海德堡曲线（2）抗体的质量抗体的特异性抗体的效价(>1:20)抗体的亲和力R型和H型抗体（R型）（3）抗原抗体反应的环境最适PH为：6.5-8.5离子强度大，IC形成快离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液（4）增浊剂PEG(6000—8000)浓度4%吐温-201.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂抗体成分2.增浊剂浓度和反应时间掌握

6、不当3.样品本身的浊度处理不当4.试剂污染变质5.比色杯不够清洁伪浊度形成的原因第三节凝胶内免疫沉淀试验第三节凝胶内免疫沉淀试验可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。原　理反应介质：凝胶凝胶的特点：1、固相的液体2、多孔的网状结构3、Ag-Ab复合物网络在凝胶中原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。技术要点：1.制板2.打孔3.加样4.扩散5.绘制标准曲线定量试验一、单

7、向免疫扩散试验抗体+琼脂沉淀环抗原倾注平板　打孔　加样　放置37℃24～48h观察沉淀环一、单向免疫扩散试验T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线t1为16-24h；t2为24-48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线待检蛋白质抗原须具备的条件仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清已知含量的标准品待测品含量在1.25g/ml以上单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理

8、血清一、单向免疫扩散试验应用IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白的检测技术要点：1.制板2.打孔3.加样4.扩散二、双向免疫扩散试验1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量2.分析抗原或抗体相对分子量二、双向免疫扩散试验3.分析抗原的性质二、双向免疫扩散试验4.滴定抗体的效价5.鉴定抗原或抗体纯度二、双向免疫扩散试验应用1.AFP检测的最早方法2.血清中含量较高的酶类、细菌病毒感染后血清中产生的抗体的检测三、免疫电泳技术优点：1.加快反应的速度